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細胞間黏附分子-1（ICAM-1）和血管細胞黏附分子-1（VCAM-1）在腦缺血損傷炎癥過程中起著重要作用。腦缺血后ICAM-1和VCAM-1表達增加；ICAM-1、VCAM-1介導循環(huán)中的白細胞與內(nèi)皮細胞黏附，進而浸潤到血管外腦實質(zhì),導致缺血后炎癥；抑制ICAM-1、VCAM-1表達及作用可減輕腦缺血損傷。

放射性肺損傷（Radiation Pulmonary leision，RPL）是胸部腫瘤放射治療和骨髓移植全身照射預處理的常見嚴重并發(fā)癥和劑量限制因素，RPL屬于非感染性炎癥，一旦發(fā)生往往不可逆轉(zhuǎn)[1]，其發(fā)病機制至今尚不清楚，缺乏有效的預測指標和治療手段，成為胸部腫瘤得到有效治療的難題。細胞間粘附分子-1(intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1)是一重要的細胞間粘附分子和炎癥介質(zhì)，編號CD54，它參與細胞的信號傳導與活化，細胞的伸展、移動、生長、分化，炎癥、血栓的形成，腫瘤轉(zhuǎn)移以及創(chuàng)傷愈合等一系列重要的生理和病理過程[2]。ICAM-1在RPL中通過介導多形核嗜中性粒細胞(polymorphonuclear, PMN)等白細胞粘附、聚集于肺泡區(qū)域，是導致肺實質(zhì)細胞損傷及持續(xù)細胞因子釋放的關鍵因素，有報道表明抗ICAM-1抗體可以降低肺損傷的程度[3-4]，但目前關于ICAM-1在RPL中的具體作用機制及是否可以作為減輕放射性肺損傷的新靶點尚待進一步研究。本文利用RNA干擾技術建立ICAM-1基因沉默細胞株以及應用基因芯片技術具體從細胞與基因水平上分析其在RPL中的作用途徑及方式，為尋找防治RPL的有效措施提供理論依據(jù)和新思路。
　　 [目的]
　　 1.采用60Coγ射線照射建立小鼠放射性肺損傷模型，探討ICAM-1及相關因子在RPL中的表達變化。
　　 2.構建ICAM-1基因沉默的小鼠肺腺癌細胞株(Lewis lung cell，LLC)，探討ICAM-1基因沉默前后LLC細胞的生物學特性及基因表達譜的變化。
　　 3.探討ICAM-1基因沉默對LLC細胞輻射敏感性的影響。
　　 [方法]
　　 1.采用照射劑量為16Gy的60Coγ射線全肺單次照射建立小鼠放射性肺損傷模型，HE染色法觀察小鼠肺組織損傷，免疫組化及Elisa法測定小鼠肺ICAM-1、轉(zhuǎn)化生長因子-β1(TGFβ1)及腫瘤壞死因子-α（TNF-α)的表達變化。
　　 2.①針對ICAM-1mRNA序列，篩選、設計并合成shRNA相關基因片段，構建3條高特異性的 shRNA表達載體pRNAT-U6.1/Neo-ICAM1-shRNA，采用酶切及DNA測序法驗證插入序列的正確性。
　　 ②脂質(zhì)體法質(zhì)粒轉(zhuǎn)染LLC細胞，遺傳霉素G418抗性篩選獲得陽性克隆。RT-PCR和Western blot法檢測shRNA對ICAM-1基因的沉默效率。
　　 ③應用倒置顯微鏡觀察ICAM-1基因沉默前后細胞形態(tài)變化，繪制生長曲線分析細胞生長分裂差異，采用MTT比色分析法測定其增殖活性，基因芯片技術分析LLC細胞中ICAM-1基因下調(diào)后全基因組表達譜的變化，篩選可能與ICAM-1信號通路有關的差異基因，尋找ICAM-1信號通路的傳導過程以及其在肺癌細胞增殖、遷移調(diào)控中的可能分子機制。
　　 3.采用照射劑量為4Gy的60Coγ射線照射ICAM-1基因沉默LLC細胞株，MTT法檢測輻照對其增殖活力的影響，集落形成率試驗檢測其對輻照敏感性的變化，流式細胞儀檢測輻照對其細胞凋亡與周期的影響，探討ICAM-1在輻照后的小鼠肺腺癌LLC細胞株中的作用機制。
　　 [結(jié)果]
　　 1.與對照組比較，照射組的小鼠至照射后隨時間延長出現(xiàn)精神萎靡，反應遲鈍，毛發(fā)有明顯脫落現(xiàn)象，肺呈充血水腫、不均質(zhì);肺泡壁增厚，炎性細胞浸潤明顯;肺組織中ICAM-1及其相關蛋白TGF-β1表達量明顯增加(P＜0.01，P＜0.05)，TNF-α表達量有所增加，但與對照組比較無統(tǒng)計學差異(P＞0.05)。
　　 2.①經(jīng)酶切和DNA測序鑒定，成功構建了3條靶向抑制小鼠ICAM-1基因及一條陰性對照的 shRNA真核表達載體pRNAT-U6.1/Neo-ICAM1-shRNA。
　　 ②成功篩選穩(wěn)定抑制ICAM-1表達的*性細胞克隆，RT-PCR及Western blot技術檢測靶細胞在mRNA水平和蛋白水平上ICAM-1的抑制率分別為76.79％和79.01％(P＜0.01)。
　　 ③與對照組比較，ICAM-1基因沉默組細胞形態(tài)發(fā)生改變，細胞生長分裂周期延長;MTT結(jié)果顯示沉默組細胞增殖活性降低;基因芯片結(jié)果提示在沉默組LLC-ICAM1細胞與對照組LLC-NC細胞間共有290個存在明顯差異表達的基因，其中表達上調(diào)的基因有238個，下調(diào)的基因有52個。
　　 3.MTT及集落形成率試驗結(jié)果表明ICAM-1基因沉默組對輻照的敏感度下降，在同等劑量的輻照條件下ICAM-1基因沉默組受到輻照后損傷程度降低，增殖活性及恢復能力均比對照組增強;流式凋亡結(jié)果顯示ICAM-1基因沉默組細胞受到輻照后24h、48h細胞凋亡率均比對照組小，且48h后恢復情況也較對照組好，輻照24h后的細胞周期G2/M期比例明顯增加，48h后比例有所下降但仍比未輻照組高，提示與細胞凋亡結(jié)果相一致。
　　 [結(jié)論]
　　 1.在16Gy60Coγ射線照射建立的小鼠放射性肺損傷模型中研究發(fā)現(xiàn)，肺組織中ICAM-1蛋白存在異常表達，且與TGF-β1、TNF-α的表達變化相一致。提示ICAM-1的表達水平的高低可能與放射性肺損傷具有一定的相關性，且與TGF-β1、TNF-α等細胞因子存在相互作用，可作為預測或評價放射性肺損傷程度的一個重要因子。
　　 2.靶向 ICAM-1基因的重組質(zhì)粒載體pRNAT-U6.1/Neo-ICAM1-shRNA構建成功，為建立ICAM-1基因沉默細胞株及后續(xù)研究奠定基礎。
　　 3.成功構建ICAM-1基因沉默細胞株，沉默細胞株的生物特性研究提示ICAM-1可能參與細胞增殖等生理活動。
　　 4.利用基因芯片技術分析ICAM-1基因沉默后全基因組表達譜的變化，發(fā)現(xiàn)ICAM-1可能通過Bax/Bcl-2、FasL/Fas、MAPK等通路參與細胞增殖、凋亡等生理過程。
　　 5.在ICAM-1在照射后LLC細胞株中的作用機制研究試驗結(jié)果中，發(fā)現(xiàn)干擾ICAM-1基因的表達，可以明顯降低LLC細胞株的輻射敏感性，增強輻射損傷后的恢復力。提示ICAM-1在放射性肺損傷中可作為基因治療潛在的分子靶點，為研究治療提供新的有效的治療策略。