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利用微型生物反應器系統(tǒng)進行實驗設計
閱讀：2648 發(fā)布時間：2016-1-26
實驗設計（DOE）是對實驗進行組織、計劃、執(zhí)行和統(tǒng)計分析的價值的方法之一。雖然可以通 過在單一生物反應器內(nèi)重復實驗獲得DoE 結(jié)果，但設計開發(fā)并行實驗的微型生物反應器系統(tǒng)（如 ambr15 或ambr250 系統(tǒng)）為完成 DoE 提供了更優(yōu)異經(jīng)濟的條件。由于工藝開發(fā)過程中涉及到眾多互相關聯(lián)的參數(shù)，如細胞系的建立，培養(yǎng)基篩選以及反應器操作參數(shù)的優(yōu)化等，DoE 逐漸成為獲得工藝知識重要且可或缺的方法。DoE 僅提高了工藝開發(fā)效率，還被用于協(xié)助確定高品質(zhì)產(chǎn)品的生產(chǎn)工藝。
結(jié)論
高通量細胞培養(yǎng)的縮小生物反應器系統(tǒng)，如 ambr15 和 ambe250 系統(tǒng)，可提高篩選的效率與有效性，以及工藝開發(fā)和工藝表征的實踐。它們提供 的優(yōu)勢在于以較小的培養(yǎng)體積同時進行大量實驗的操作。與此同時，小規(guī)模的一次性攪拌釜容器能夠提供與大規(guī)模生物反應器具有優(yōu)異可比性的培養(yǎng)環(huán)境和生物反應器性能（7–9）。摒棄試錯優(yōu)化的傳統(tǒng)方式，采用先進的DoE 方法，實現(xiàn)快速、有效的地鑒定關鍵工藝參數(shù)，促使成本的顯著降低與開發(fā)時間的大量縮減。
實驗設計：有效策略
在生物制藥工藝中，縮短開發(fā)時間和 降低生產(chǎn)成本是關鍵的目標。在此背景下，工藝分析技術（PAT）工具與靈活可靠的生物工藝開發(fā)設備的聯(lián)合應用便成了有效優(yōu)化現(xiàn)有生產(chǎn)工藝和開發(fā)新工藝的基礎。FDA鼓勵使用PAT來更好地理解和控制生產(chǎn)過程，基于統(tǒng)計的DoE方法則被廣泛應用于優(yōu)化條件，用zui少時間和實驗量獲得*工藝條件的過程中（1）。
DoE概念即根據(jù)一系列計劃好的實驗同步改變工藝參數(shù)，然后通過一個已驗證的數(shù)學模型來說明結(jié)果。該模型后續(xù)可用于解釋、預測和優(yōu)化，還可助于更好地理解工藝。對比每次改變一個因素的單因素實驗，DoE方案可以用zui少的實驗量獲得*化得結(jié)果，因此可以縮短開發(fā)時間，減少人工投入。
基礎培養(yǎng)基和流加培養(yǎng)基組份的 優(yōu)化對形成*的重組細胞系生長及合成活性藥物蛋白環(huán)境至關重要（2）。另一個影響工藝開發(fā)的關鍵目標是優(yōu)化基本工藝參數(shù)，如溫度、pH和溶氧（3）。通常，培養(yǎng)基和工藝參數(shù)的優(yōu)化是密切相關的，DoE正好勝任此類任務（1）。
在生物制藥工藝中，縮短開發(fā)時間和 降低生產(chǎn)成本是關鍵的目標。在此背景下，工藝分析技術（PAT）工具與靈活可靠的生物工藝開發(fā)設備的聯(lián)合應用便成了有效優(yōu)化現(xiàn)有生產(chǎn)工藝和開發(fā)新工藝的基礎。FDA鼓勵使用PAT來更好地理解和控制生產(chǎn)過程，基于統(tǒng)計的DoE方法則被廣泛應用于優(yōu)化條件，用zui少時間和實驗量獲得*工藝條件的過程中（1）。
DoE概念即根據(jù)一系列計劃好的實驗同步改變工藝參數(shù)，然后通過一個已驗證的數(shù)學模型來說明結(jié)果。該模型后續(xù)可用于解釋、預測和優(yōu)化，還可助于更好地理解工藝。對比每次改變一個因素的單因素實驗，DoE方案可以用zui少的實驗量獲得*化得結(jié)果，因此可以縮短開發(fā)時間，減少人工投入。
基礎培養(yǎng)基和流加培養(yǎng)基組份的 優(yōu)化對形成*的重組細胞系生長及合成活性藥物蛋白環(huán)境至關重要（2）。另一個影響工藝開發(fā)的關鍵目標是優(yōu)化基本工藝參數(shù)，如溫度、pH和溶氧（3）。通常，培養(yǎng)基和工藝參數(shù)的優(yōu)化是密切相關的，DoE正好勝任此類任務（1）。
從培養(yǎng)基和補料開發(fā)轉(zhuǎn)移至工藝優(yōu)化
除去特定細胞系的產(chǎn)率，培養(yǎng)基對藥物蛋白和單克隆抗體的產(chǎn)量和效價有著重要影響。細胞需要大量和微量營養(yǎng)糖組合，如糖，無機鹽，維生素，氨基酸和其它支持細胞生長和蛋白生產(chǎn)的成份等。由于每一種細胞都具有*的營養(yǎng)需求，以及培養(yǎng)基成分復雜，采用具有高通量平行實驗能力的微型反應器系統(tǒng)成為打破工藝開發(fā)瓶頸的有力手段。
以往基礎和補料培養(yǎng)基配方的確定是通過逐次改變因素的大量經(jīng)驗性試驗摸索獲得的（4）。這種方法雖然簡單便捷，但是它忽略了成份之間的相互作用，可能無法獲得*配方，而且相當費時。應對的*策略就是采用高通量微型反應器結(jié)合 DoE 設計方法來縮短培養(yǎng)基開發(fā)時間。
除了改進培養(yǎng)基組份，補料控制策略的優(yōu)化對流加工藝也是有利的。實際方法取決于生物反應器系統(tǒng)本身和細胞系。而一個經(jīng)典的持續(xù)補料的 流加策略已被證明可成功應用于大腸桿菌和巴斯德畢赤酵母的培養(yǎng)。出于控制簡單和可放大的考慮，哺乳動物細胞培養(yǎng)采用階梯式推進補料方法是行業(yè)內(nèi)zui普遍的做法（5, 6）。
擁有 12 或 24 個一次性攪拌反應器的新 ambr250 工作站（TAP Biosystems公司，賽多利斯子公司之一），是一種有效的應用于微生物發(fā)酵或細胞培養(yǎng)早期工藝開發(fā)高通量比例縮小模型。該系統(tǒng)所具備的能力包括連續(xù)實時監(jiān)視和控制關鍵參數(shù)，增加的補料取樣選項，使得它比傳統(tǒng)小試和中試反應器相比，具有等效但更高 效的工藝放大效果（7–9）。
自動化工作站的特點是具有一個集成液體處理器，它可以移除一次性容器的蓋子，用于初始培養(yǎng)基的裝載、接種、取樣和補料流加。培養(yǎng)或補料培養(yǎng)基可以通過移液模塊轉(zhuǎn)移預配方培養(yǎng)基，或者可根據(jù)導入的實驗設計數(shù)據(jù)系統(tǒng)自動配制不同成份的培養(yǎng)基。除了單次流加（10 μL 至 10 mL） 方式，內(nèi)置泵還允許線性或指數(shù)性地連續(xù)進料，范圍從 20 nL/h 到20 mL/h。
一旦zui主要的培養(yǎng)基成份和它們的*范圍被確定，則工藝可以被轉(zhuǎn)移至一個較大的小試規(guī)模系統(tǒng)中進行驗證可放大性，并繼續(xù)進行優(yōu)化操作 參數(shù)和工藝條件。
Biostat® B-DCU II 臺式生物反應器（Sartorius Stedim Biotech）是一種專門設計用于六個玻璃反應器或一次性 反應器并行實驗的小試系統(tǒng)。它在行業(yè)中被廣泛用于工藝優(yōu)化和驗證（10）。每個反應器都有獨立的控制參數(shù)和自動測量功能。系統(tǒng)經(jīng)預先配置，可立即使用，并且它們可以用于微生物發(fā)酵或細胞培養(yǎng)。
除去特定細胞系的產(chǎn)率，培養(yǎng)基對藥物蛋白和單克隆抗體的產(chǎn)量和效價有著重要影響。細胞需要大量和微量營養(yǎng)糖組合，如糖，無機鹽，維生素，氨基酸和其它支持細胞生長和蛋白生產(chǎn)的成份等。由于每一種細胞都具有*的營養(yǎng)需求，以及培養(yǎng)基成分復雜，采用具有高通量平行實驗能力的微型反應器系統(tǒng)成為打破工藝開發(fā)瓶頸的有力手段。
以往基礎和補料培養(yǎng)基配方的確定是通過逐次改變因素的大量經(jīng)驗性試驗摸索獲得的（4）。這種方法雖然簡單便捷，但是它忽略了成份之間的相互作用，可能無法獲得*配方，而且相當費時。應對的*策略就是采用高通量微型反應器結(jié)合 DoE 設計方法來縮短培養(yǎng)基開發(fā)時間。
除了改進培養(yǎng)基組份，補料控制策略的優(yōu)化對流加工藝也是有利的。實際方法取決于生物反應器系統(tǒng)本身和細胞系。而一個經(jīng)典的持續(xù)補料的 流加策略已被證明可成功應用于大腸桿菌和巴斯德畢赤酵母的培養(yǎng)。出于控制簡單和可放大的考慮，哺乳動物細胞培養(yǎng)采用階梯式推進補料方法是行業(yè)內(nèi)zui普遍的做法（5, 6）。
擁有 12 或 24 個一次性攪拌反應器的新 ambr250 工作站（TAP Biosystems公司，賽多利斯子公司之一），是一種有效的應用于微生物發(fā)酵或細胞培養(yǎng)早期工藝開發(fā)高通量比例縮小模型。該系統(tǒng)所具備的能力包括連續(xù)實時監(jiān)視和控制關鍵參數(shù)，增加的補料取樣選項，使得它比傳統(tǒng)小試和中試反應器相比，具有等效但更高 效的工藝放大效果（7–9）。
自動化工作站的特點是具有一個集成液體處理器，它可以移除一次性容器的蓋子，用于初始培養(yǎng)基的裝載、接種、取樣和補料流加。培養(yǎng)或補料培養(yǎng)基可以通過移液模塊轉(zhuǎn)移預配方培養(yǎng)基，或者可根據(jù)導入的實驗設計數(shù)據(jù)系統(tǒng)自動配制不同成份的培養(yǎng)基。除了單次流加（10 μL 至 10 mL） 方式，內(nèi)置泵還允許線性或指數(shù)性地連續(xù)進料，范圍從 20 nL/h 到20 mL/h。
一旦zui主要的培養(yǎng)基成份和它們的*范圍被確定，則工藝可以被轉(zhuǎn)移至一個較大的小試規(guī)模系統(tǒng)中進行驗證可放大性，并繼續(xù)進行優(yōu)化操作 參數(shù)和工藝條件。
Biostat® B-DCU II 臺式生物反應器（Sartorius Stedim Biotech）是一種專門設計用于六個玻璃反應器或一次性 反應器并行實驗的小試系統(tǒng)。它在行業(yè)中被廣泛用于工藝優(yōu)化和驗證（10）。每個反應器都有獨立的控制參數(shù)和自動測量功能。系統(tǒng)經(jīng)預先配置，可立即使用，并且它們可以用于微生物發(fā)酵或細胞培養(yǎng)。
結(jié)論
高通量細胞培養(yǎng)的縮小生物反應器系統(tǒng)，如 ambr15 和 ambe250 系統(tǒng)，可提高篩選的效率與有效性，以及工藝開發(fā)和工藝表征的實踐。它們提供 的優(yōu)勢在于以較小的培養(yǎng)體積同時進行大量實驗的操作。與此同時，小規(guī)模的一次性攪拌釜容器能夠提供與大規(guī)模生物反應器具有優(yōu)異可比性的培養(yǎng)環(huán)境和生物反應器性能（7–9）。摒棄試錯優(yōu)化的傳統(tǒng)方式，采用先進的DoE 方法，實現(xiàn)快速、有效的地鑒定關鍵工藝參數(shù)，促使成本的顯著降低與開發(fā)時間的大量縮減。
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1.重組蛋白優(yōu)化表達：案例研究
2. 通向成功的流程
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