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SARS-CoV-2 核蛋白 ELISA 试剂盒说明书
阅读：667 发布时间：2025-1-10一、检测原理
本试剂盒采用 ELISA 双抗体夹心法原理。用纯化的 SARS-CoV-2Nucleoprotein 抗体包被微孔板，向已包被板微孔中依次加入标准品及待测样本，同时加入 HRP 标记的 SARS-CoV-2Nucleoprotein 抗体，形成抗体 - 抗原 - 酶标检测抗体复合物，经过洗涤后加入底物 TMB 显色。TMB 在 HRP 酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的 SARS-CoV-2Nucleoprotein 呈正相关。用酶标仪在 450nm 波长下测定吸光值（OD 值），通过绘制标准曲线计算样品中 SARS-CoV-2 Nucleoprotein 浓度。
二、试剂盒组成
试剂盒组成 | 规格（96T） | 保存条件 |
抗体包被板条 | 8×12 | 2 - 8℃保存 |
标准品 | 1 ml×2 瓶 | 2 - 8℃保存 |
S1 标准品 / 样本稀释液 | 15 ml×1 瓶 | 2 - 8℃保存 |
检测抗体浓缩液（100×） | 30μl×2 瓶 | 2 - 8℃保存 |
S2 检测抗体稀释液 | 15ml×1 瓶 | 2 - 8℃保存 |
浓缩洗涤液（20×） | 30ml×1 瓶 | 2 - 8℃保存 |
显色底物（避光） | 12ml×1 瓶 | 2 - 8℃保存 |
终止液 | 6ml×1 瓶 | 2 - 8℃保存 |
封板胶纸 | 4 张 | |
说明书 | 1 份 |
三、其它实验材料（不提供，但可协助购买）
1. 酶标仪 (主波长 450nm，参考波长 630nm)
2. 高精度可调移液器（已校准）及吸头：0.5 - 10,2 - 20,20 - 200,200 - 1000μl。一次检测样本较多时，建议使用多通道移液器。
3. 自动洗板机或洗瓶
4. 微量振荡器
5. 双蒸水或去离子水
6. 坐标纸
7. 量筒
四、注意事项
8. 试剂盒保存在 2 - 8℃，未用完的标准品，建议丢弃。不可混合使用不同来源或不同批号的试剂盒组分，请在有效期内使用本产品。
9. 浓缩洗涤液低温取出可能会伴有结晶析出，稀释时可在水浴中加热助溶，不影响使用。
10. 各步加样均应使用移液器，并经过校准，以免产生误差。建议一次加样时间最好控制在 5 分钟内，如样本数量较多，推荐使用排枪加样。
11. 请每次测定的同时做标准曲线，最好做复孔。如样本中待测物质含量高于试剂盒检测上限（样本 OD 值大于标准品孔第一孔的 OD 值），请先用样本稀释液稀释一定的倍数（n 倍）后再测定，计算时需乘以总稀释倍数。
12. 为避免交叉污染，在加入不同浓度的标准品、不同样本、不同试剂时谨记及时更换吸头，封板胶纸只限一次性使用。
13. 浓缩酶结合物及显色底物请避光保存，显色底物在添加之前，应保持无色，请勿使用已变为蓝色的显色底物。
14. 严格按照说明书的操作进行，试验结果判定必须以酶标仪读数为准。
五、样本收集、处理及保存方法
15. 细胞上清液：将培养基移至离心管内，于 4℃下，1500rpm 离心 10 分钟，取上清进行分装并在 - 80℃下保存样品，尽可能减少反复冻融次数。
16. 细胞提取物：吸取培养基并用预冷 PBS 洗涤细胞一次，吸出 PBS，在 100 mm 培养板加入 0.5ml 提取缓冲液。收集细胞至经过预冷的离心管中，短暂涡旋后在冰上孵育 15 - 30 分钟，于 4℃下 13000rpm 离心 10 分钟，将上清液（这里是指可溶性细胞提取物）分装至预冷的离心管中，并于 - 80℃保存，尽可能减少反复冻融次数。
提取缓冲液：100 mM Tris（pH 7.4）、150 mM NaCl、1 mM EGTA、1 mM EDTA、1% Triton X - 100、0.5% 脱氧胆酸钠、磷酸酶抑制剂混合物、蛋白酶抑制剂混合物、PMSF。
17. 若样本无法立即检测，请将其按最小使用量分装， - 20℃ — - 80℃保存，避免反复冻融。如果样本中含有大量颗粒，检测前先离心或过滤去除；室温下解冻，请勿于 37℃或更高的温度加热解冻。
18. 不能检测含 NaN3 的样本，因 NaN3 抑制辣根过氧化物酶的活性。
19. 请根据实际情况，将样本做适当倍数稀释（建议根据预试验结果确定稀释倍数）。
六、试剂准备
20. 试剂回温：请在实验前 30min 内，将试剂盒和待测样本置于室温下回温。
21. 洗涤液配制：根据浓缩洗液的浓缩倍数，用双蒸水或去离子水进行相应倍数稀释后备用。
22. 标准品梯度稀释：取出试剂盒提供的标准品（25ng/ml），然后取 5 只聚丙烯试管，各加入 500μl 标准品 / 样本稀释液（S1），按照以下浓度进行 2 倍稀释：25、12.5、6.25、3.125、1.56、0.78 ng/ml 进行稀释。25ng/ml 为标准曲线最高点浓度，标准品 / 样本稀释液（S1）作为标准曲线的零点（0ng/ml）。使用过的标准品原液（25ng/ml）未用完的应废弃或根据需要按照一次用量分装，并将其贮存在 - 20～ - 80℃冰箱。
23. 检测抗体工作液：根据试验所需用量，用检测抗体稀释液（S2）将检测抗体浓缩液（100×）稀释成 1 倍应用工作液，请于 30min 内使用。
七、操作步骤
24. 加样：根据试验所需用量，取出相应抗体包被板条，分别将已配制好的标准品、标准品零点（S1）及待测样本以 50μl / 孔加入实验孔底部，尽量不触及孔壁，同时，各实验孔加入检测抗体工作液（50μl / 孔），充分混匀。
25. 温育：用封板膜封板后置 37℃温育 90 分钟。
26. 洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置 30 秒后弃去，如此重复 5 次，拍干。
27. 显色：每孔加入 100μl 显色底物，用封板胶纸封板后室温显色 10 - 20min。
28. 终止：每孔加终止液 50μl（此时蓝色立转黄色）。
29. 测定：用酶标仪 450nm 波长测定各孔的吸光度（OD 值），测定应在加终止液后 5min 以内进行。
八、结果判断
30. 建议采用双波长读数，即每个标准品和样本的 450nm OD 值减去 630nm OD 值，为最终数值，如果做复孔，求其平均值。
31. 使用计算机软件以吸光度 OD 值为纵坐标 (Y)，相应的 SARS-CoV-2Nucleoprotein 标准品浓度为横坐标 (X)，生成标准曲线，样本的 SARS-CoV-2 应稀释倍数。
本图仅供参考，应以同次试验标准品所绘标准曲线为准
九、试剂盒性能
批内与批间差应小于 10%
十、检测范围
0.78 ng/ml - 25 ng/ml
十一、灵敏度
0.4 ng/ml
十二、常见问题分析及解决办法
问题 | 可能原因 | 解决办法 |
无颜色 | 不同试剂盒或不同批号的试剂混合 | 重新检查试剂的标签，确准所有组分都属于正使用的试剂盒中的。不能混用不同试剂盒或不同批号的试剂。 |
漏加抗体、酶、显色剂 | 检查操作流程，注意不要漏加 | |
HRP 酶污染了叠氮钠 | 使用新配制的试剂，禁含叠氮钠 | |
试剂配制 / 使用有误 | 重做试验，严格按说明书操作，每次配制和使用前看清标签 | |
显色弱 | 超过有效期的产品可能会产生很弱的信号 | 检查产品有效期 |
缩短孵育时间能使实验信号变弱 | 检查孵育时间 | |
使用了被污染的试剂 | 检查试剂是否被污染 | |
仪器设定不正确，滤光片不匹配 | 仪器是否设定正确，滤光片的使用等 | |
洗涤操作不规范 | 洗涤不充分，使用手工洗板常出现，洗瓶洗涤，每孔应充满洗涤缓冲液，倾出时应迅速。若用洗板机，应校准并设定足够充满每孔的体积量。板内侧不应接触设备，检查每孔是否有残留的洗液或每孔加样量的体积是否准确，可在两次洗板之间加 30 秒的浸泡 | |
高背景 | 实验中孵育温度和时间不适当 | 确定每一试验步骤的孵育温度和时间是否适当 |
酶加量过多 | 加酶前验看移液器调节量是否准确，检查稀释度，若必要进行效价测定 | |
标曲佳但样本孔无信号 | 样本中靶标物含量低或样本中无靶标物 | 设置阳性对照，重复实验 |
样本基质效应影响检测 | 重新稀释样本后复测 | |
标曲佳但样本信号偏高 | 样本中待检物含量超过标准曲线范围 | 重新稀释样本后复测 |