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细菌糖类总量硫酸-苯酚比色法定量检测试剂盒产品说明书

 

主要用途

 

细菌糖类总量硫酸-苯酚比色法定量检测试剂是一种旨在通过硫酸处理后，水解产生单糖，与苯酚反应，生成黄色产物，即采用比色法测算糖类总量的而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。其适合于各种细菌细胞样品中糖类总量的检测。产品即到即用，操作简捷，性能稳定，检测敏感。

 

技术背景

 

糖类（saccharide），又称为碳水化合物（carbohydrate），其分成四类：单糖（monosaccharide；例如葡萄糖）、二糖（disaccharide；例如蔗糖）、寡糖（oligosaccharide；棉籽糖）和多糖（polysaccharide；例如淀粉和糖原）。糖类构成辅酶和核酸，以及细胞结构的重要元素，在能量储存、免疫功能、授精、预防病理变化、血液凝结、发育等方面具有重要作用。使用浓硫酸，将复杂性多糖水解成单糖，脱水产生反应性中间产物，与苯酚反应，生成黄色产物，在分光光度仪（492nm 波长）下出现吸光峰值的变化，来定量测定样品中糖类量的总含量。 

 

产品内容

 

稀释液（Reagent A）                    5毫升

反应液（Reagent B）                    5毫升

酸性液（Reagent C）                   25毫升

标准液（Reagent D）                  500微升

裂解液（Reagent E）                   10毫升

产品说明书               1份

 

保存方式

 

保存在4℃冰箱里；酸性液（Reagent C）具有腐蚀性，注意操作安全；反应液（Reagent B）避免光照；有效保证6月

 

用户自备

 

1.5毫升离心管：用于标准样品配制和反应的容器

干式恒温仪或恒温水槽：用于反应孵育

超声仪：用于裂解细菌细胞

比色皿：用于比色的容器

分光光度仪：用于比色分析

 

 

 

实验步骤

 

一、 样品准备

 

1． 准备好10毫升待测的细菌放进37℃摇床孵育16小时，速度为220RPM

2． 直至OD600＝0.4至0.8，即1至2 X 10⁷细胞/毫升

3． 置于冰槽里5分钟

4． 放进4℃台式离心机离心5分钟，速度为1000g

5． 小心抽去上清液

6． 加入500微升裂解液（Reagent E），充分混匀

7． 转移到预冷的1.5毫升离心管

8． 强力涡旋震荡15秒

9． 置于超声仪下：200瓦，50%功率，10秒一次，重复3次

10． 冰槽里静置15分钟

11． 放进4℃微型台式离心机离心15分钟，速度为16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）

12． 小心移取500微升上清液到新的预冷的1.5毫升离心管

13． 移取10微升进行蛋白定量检测（注意：建议使用 Bradford蛋白质浓度定量试剂盒－30030.1）

14． 即刻放进－70℃保存或置于冰槽里继续后续操作

 

二、标准样品配制

 

1． 准备好5个1.5毫升离心管，标记为1至5号管

2． 分别加入200微升稀释液（Reagent A）到每个离心管

3． 移取200微升标准液（Reagent D）到1号管，混匀

4． 小心移取200微升1号管稀释的标准液（Reagent D）到2号管，混匀

5． 小心移取200微升2号管稀释的标准液（Reagent D）到3号管，混匀

6． 小心移取200微升3号管稀释的标准液（Reagent D）到4号管，混匀

7． 将1至5号管放进冰槽里备用，避免光照；标准管浓度见下表

 

 

 

三、 样品测定

 

1． 设定好分光光度仪：波长492nm，并置零

2． 分别移取200微升反应液（Reagent B）到1.5毫升离心管

3． 分别加入200微升上述制备的标准样品或待测样品，混匀

4． 分别加入1毫升酸性液（Reagent C），混匀

5． 在80℃干式恒温仪孵育30分钟（注意：如果复杂多糖无法充分水解，建议使用煮沸5至30分钟处理）

6． 室温下冷却10分钟，避免光照

7． 转移到新的比色皿

8． 即刻放进分光光度仪检测（492nm波长）：获得吸光读数

9． 构建标准曲线：纵座标（Y轴）为吸光读数；横座标（X轴）为标准麦芽糖含量（微克）

10． 根据标准曲线获得样品对应麦芽糖含量（微克）

11． 计算样品实际麦芽糖浓度（微克/毫升） 

 

【根据标准曲线获得样品对应麦芽糖含量（微克）÷0.2（样品容量：毫升）】×10（样品稀释倍数）=微克/毫升

 

注意事项

 

1． 本产品为25次操作，包括标准液

2． 本产品适用于还原性、非还原性糖类、寡糖以及复杂性糖类，但不适合于氨基糖或脱氧糖及其衍生物

3． 本产品检测范围为0.2至50微克糖类总量

4． 本产品适用于96孔板操作，实际用量按比例减少

5． 操作时，须戴手套

6． 酸性液（Reagent C）具有腐蚀性，注意操作安全

7． 孵育时，避免光照

8． 如果待测样品浓度过高或过低，可以稀释样品用量；注意在计算实际浓度时，不要忘记稀释倍数调整

9． 糖类总量表述方式：微克麦芽糖/毫升；微克麦芽糖/细胞量；微克麦芽糖/总蛋白量

10． 本公司提供系列糖类检测试剂产品

 

质量标准

 

1． 本产品经鉴定性能稳定

2． 本产品经鉴定检测敏感