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體液糖胺多糖（GAG）總含量二甲基亞甲基藍（DMMB）比色法定量檢測

試劑盒產品說明書

 

主要用途

 

體液糖胺多糖（GAG）總含量二甲基亞甲基藍（DMMB）比色法定量檢測試劑是一種旨在通過高鹽萃取可溶性糖胺多糖，與二甲基亞甲基藍染料結合，在丙醇解離溶液中，釋放紫紅色染料，由分光光度儀比色分析，定量檢測組織樣品中糖胺多糖含量的而經典的技術方法。該技術經過精心研制、成功實驗證明的。適用于各種人體或動物體液（例如腦脊液、關節滑液、尿液等），以及細胞培養液的糖胺多糖水平檢測。產品嚴格無菌，即到即用，操作簡捷，性能穩定，檢測準確。

 

技術背景

 

糖胺多糖（glycosaminoglycan；GAG），又稱為粘多糖（mucopolysaccharide），是體內最為豐富的異源多聚糖。糖胺多糖是一種未分叉的負電荷性長鏈多聚糖，由重復的二糖單位，包括六碳糖（hexose）或己糖醛酸（hexuronic acid），鏈接到己糖胺（hexoamine）上而成。糖胺多糖與核心蛋白（core protein）共價相聯，構成蛋白多糖（proteoglycan；PG），成為細胞膜和細胞外基質（extracellular matrix；ECM）的主要成分。蛋白多糖的糖胺多糖在合成過程中發生硫酸酯化（sulfated group），其部位在O或N位上，有利于發揮各種不同的作用，包括酶的調節、細胞黏附、生長、遷移、分化，以及組織損傷反應。基于糖胺多糖的高度負電荷的特點，使用異染性（metachromatic）陽離子藍色染料二甲基亞甲基藍（1,9-dimethylmethylene blue；DMMB），在酸性條件下，特異性的結合產生不溶性紫色或粉紅色糖胺多糖染料復合物（Dye-GAG complex），在丙醇解離溶液中，釋放出染料，通過分光光度儀（656nm波長）測定，來定量分析糖胺多糖的總含量。 

 

產品內容

 

清理液（Reagent A）                1毫升

萃取液（Reagent B）                1毫升

染色液（Reagent C）            25毫升

解離液（Reagent D）            25毫升

標準液（Reagent E）           100微升

產品說明書            1份

 

保存方式

 

保存萃取液（Reagent B）在－20℃冰箱里；其余的保存在4℃冰箱里；染色液（Reagent C）避免光照；有效保證6月

 

用戶自備

 

1.5毫升離心管：用于樣品操作的容器

15毫升錐形離心管：用于樣品操作的容器

恒溫水槽或干式恒溫儀：用于樣品反應

微型臺式離心機：用于樣品操作

比色皿或96孔板：用于比色分析的容器

分光光度儀或酶標儀：用于比色分析

 

實驗步驟

 

一、樣品預處理  

 

1． 準備好1.5毫升離心管

2． 移取1毫升液體（尿液/腦脊液/唾液/精液/關節液/培養液樣品）到離心管

3． 放進4℃微型臺式離心機離心10分鐘，速度為700g（或3000RPM，例如eppendorf 5415）

4． 小心移取500微升上清液到新的1.5毫升離心管

5． 加入50微升萃取液（Reagent B） 

6． 強力渦旋震蕩1分鐘，充分混勻

7． 放進56℃恒溫水槽孵育16小時

8． 放進90℃恒溫水槽孵育10分鐘

9． 放進微型臺式離心機離心10分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）

10． 小心移取上清液到新的1.5毫升離心管

11． 置于冰槽里備用

 

二、標準樣品配制

 

1． 準備好5個1.5毫升離心管，標記為1至5號管

2． 分別加入50微升清理液（Reagent A）到1至5號管

3． 移取50微升標準液（Reagent E）到1號管，混勻

4． 小心移取50微升1號管稀釋的標準液（Reagent E）到2號管，混勻

5． 小心移取50微升2號管稀釋的標準液（Reagent E）到3號管，混勻

6． 小心移取50微升3號管稀釋的標準液（Reagent E）到4號管，混勻

7． 將1至5號管放進冰槽里備用；標準管濃度見下表

 

 

三、 標準曲線測定

 

1． 移取50微升上述配制的標準液（Reagent E）到1.5毫升離心管

2． 加入1毫升染色液（Reagent C）

3． 渦旋震蕩15秒

4． 室溫下孵育30分鐘，避免光照，期間每隔5分鐘渦旋震蕩15秒

5． 即刻放進微型臺式離心機離心10分鐘，速度為16000g

6． 小心抽去上清液（注意：確保沒有水滴殘留）（注意：可見紫色或粉紅色沉淀）

7． 加入1毫升解離液（Reagent D）

8． 渦旋震蕩15秒

9． 室溫下孵育5分鐘，避免光照（注意：確保充分溶解）

10． 轉移到新的比色皿

11． 即刻放進分光光度儀檢測（波長656nm）：獲得標準樣品吸光讀數

12． 重復實驗步驟1至11四次

13． 構建標準曲線：縱座標（Y軸）為吸光讀數；橫座標（X軸）為標準糖胺多糖含量（微克）

 

四、 樣品測定

 

1． 加入50微升上述制備的待測樣品到1.5毫升離心管

2． 加入1毫升染色液（Reagent C）

3． 渦旋震蕩15秒

4． 室溫下孵育30分鐘，避免光照，期間每隔5分鐘渦旋震蕩15秒

5． 即刻放進微型臺式離心機離心10分鐘，速度為16000g

6． 小心抽去上清液（注意：確保沒有水滴殘留）（注意：可見紫色或粉紅色沉淀）

7． 加入1毫升解離液（Reagent D）

8． 渦旋震蕩15秒

9． 室溫下孵育5分鐘，避免光照（注意：確保充分溶解）

10． 轉移到新的比色皿

11． 即刻放進分光光度儀檢測（波長656nm）：獲得樣品吸光讀數

12． 根據上述標準曲線獲得樣品對應糖胺多糖含量（微克）

 

五、 濃度計算

 

根據上述標準曲線樣品對應糖胺多糖含量（微克）÷0.050（樣品容量；毫升）＝微克糖胺多糖/毫升 

 

注意事項

 

1． 本產品為25次操作，包括標準樣品

2． 本產品不適合于非硫酸酯化的二糖降解片段、透明質酸（hyaluronate）的檢測

3． 本產品可以檢測硫酸軟骨素（chondroitin sulfate）、硫酸角質素（keratan sulfate）、硫酸皮膚素（dermatan sulfate）、硫酸類肝素（heparan sulfate）等主要糖胺多糖

4． 本產品檢測范圍為0.2至5微克糖胺多糖

5． 操作時，須戴手套

6． 系統操作時，標準樣品測定只需1次

7． 空白對照讀數通常小于0.06，如果超過表明抽去上清操作不當

8． 孵育時，避免光照

9． 如果樣品糖胺多糖含量過低，可以濃縮樣品或增加樣品量至100微升

10． 樣品濃度可以表述為：微克糖胺多糖/總蛋白等

11． 本公司提供系列糖類代謝檢測試劑產品

 

 

質量標準

 

1． 本產品經鑒定性能穩定

2． 本產品經鑒定檢測敏感