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技术文章

基因甲基化特异性PCR扩增(MSP)试剂盒产品说明书

阅读:1100          发布时间:2022-10-18

主要用途


基因甲基化特异性PCR扩增(MSP)试剂盒是一种旨在通过设计符合胞嘧啶转化的特殊引物,对转化基因组的CpG岛区域进行PCR扩增,探测基因甲基化信息的而经典的技术方法。该技术由大师级科学家精心研制、成功实验证明的。可以被用于父母印记、X染色体研究、肿瘤抑制基因等表观遗传学研究。产品即到即用,性能稳定,操作简便,扩增效率显著。


技术背景


在基因的启动子区域(promotor region)通常存在一些富含重复双核苷酸“"的区域,称为“岛"( island)。在人类基因组内,存在有近3万个岛。这些岛不仅是基因的一种标志,而且还参与基因表达的调控和影响染色质的结构,更是DNA甲基化的位置。岛甲基化形态的扫描分析是基因表达和表观基因组学的主要课题。


保存方式


保存在-20℃冰箱里;有效保证6月


用户自备

转化样品:经过亚硫酸盐转化的目标DNA分子

特异引物:用于甲基化基因扩增的引导DNA分子

PCR仪:用于样品扩增

PCR管或平板:用于PCR反应的容器



实验步骤

实验开始前,从-20℃冰箱中取出试剂,放进冰槽里融化。然后进行下列操作:

1.针对一个样本,每次移出15微升扩增液(Reagent A)到PCR管

2.加入1微升用户自备的的转化或野生型DNA样品(总量100纳克)

3.分别加入1微升用户自备的甲基化特异性的引物F和引物R(各350纳克或25微摩尔)

4.再加入7微升补充液(Reagent B)(反应总量为25微升)

5.即刻放进微型台式离心机瞬时离心5秒,速度为500g(或2000RPM;例如eppendorf 5415)

6.加入50微升PCR级矿物油(注意:参见注意事项10)

7.即刻进行热启动PCR反应:


注意事项


1.本产品为60次操作

2.操作时,须戴手套

3.建议使用带滤芯的枪头,避免污染

4.转化后的DNA样本须保存在-20℃冰箱里,否则容易降解;同时尽快进行扩增等后续操作

5.一个特定基因的甲基化检测通常包括转化、PCR和直接测序三步。PCR用于筛选和定位,可以发现0.1%甲基化;测序是精确定位,是分析金标准

6.一个特定基因的甲基化特异性PCR通常包括三组PCR: 野生型(W)、转化后甲基型(M)、转化后非甲基型(U)

7.甲基化特异性PCR的引物设计原则:引物以SENSE的DNA链为模板;引物含有足够多的C(后面不和G相连);引物含有1-3个位点;位点须在3端;PCR片段长度在80-250碱基;三组引物取自同一位点,通过长度变化获得相同的Tm,并在电泳上有所区别。

8.直接测序的引物设计原则是:引物不能含有CPG位点;引物含有足够多的C(不和G相连);采用巢式引物

9.基因甲基化区域选择原则:如果是一个检测的基因,首先,选择启动子部位;第二,选择足够多的CPG位点;第三、 选择200碱基以上区域,且GC超过50%

10.通过1.8%琼脂糖凝胶或15%聚丙烯酰胺凝胶电泳来检测PCR扩增后的结果。假如DNA样品在修饰前是未甲基化的,那么仅仅“U"Primers将产生扩增产物;相反,已甲基化的DNA样品仅仅用“M"Primer能被扩增

11.组织样品或杂合子样品常常出现“U"和“M"同时呈现阳性;建议使用基因甲基化程度定量分析试剂盒(20024.3)予以分析

12.根据用户PCR仪的性能,决定是否加入矿物油(Mineral Oil)

13.建议使用软件测算Tm温度;参考公式为Tm=4(G+C)+2(A+T)

14.在-20℃冰箱里储存的产品避免反复冻融



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