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酵母細胞線粒體粗提分離試劑盒產品說明書
閱讀：846 發布時間：2022-8-23主要用途
真菌/酵母細胞線粒體粗提分離試劑是一種旨在使用生物、化學和物理方法相結合，有效去除真菌/酵母菌細胞壁，進一步快速且充分裂解真菌/酵母菌細胞，從而分離出完整而純化的線粒體細胞器的而經典的技術方法。該技術經過精心研制、成功實驗證明的。適合于各種新鮮培養或凍存的野生型或突變型真菌/酵母菌菌株細胞的線粒體的制備。其制備物產量高，可以被用于細胞凋亡、信號傳遞、代謝和蛋白組學等研究。產品不含污染性蛋白酶和核酶，即到即用，性能穩定，分離產量和純度堪稱同類產品*佳。
技術背景
線粒體細胞器的分離是現代細胞生物學研究的手段之一。從任何組織或細胞分離線粒體的技術方法基本上采用：第一，通過機械或化學方法破裂細胞；第二，通過低速差速離心去除殘渣碎屑和巨大細胞器；第三，通過高速差速離心獲得線粒體；甚至，第四，可以通過等密度離心獲得純度更高的線粒體。
產品內容
清理液（Reagent A） 250毫升
平衡液（Reagent B） 250毫升
酶解液（Reagent C） 500微升
裂解液（Reagent D） 40毫升
凈化液（Reagent E） 10毫升
強化液（Reagent F） 5毫升
保存液（Reagent G） 100毫升
產品說明書 1份
保存方式
保存酶解液（Reagent C）和凈化液（Reagent E）在－20℃冰箱里，其余的保存在4℃冰箱里，嚴格避免污染；有效保證6月
用戶自備
15毫升錐形離心管：用于線粒體初步制備物的存放
50毫升錐形離心管：用于細胞收集后離心或清洗
1.5毫升離心管：用于保存線粒體
4℃臺式離心機：用于沉淀細胞
4℃臺式高速離心機：用于分離細胞器成分
恒溫水槽：用于孵育反應物
DOUNCE勻漿器：用于裂解細胞
實驗步驟
實驗開始前，將試劑盒里的凈化液（Reagent E）凍融，然后移出1毫升凈化液（Reagent E）到4毫升的裂解液（Reagent D）里，混勻后，置入冰槽里，標記為裂解工作液。然后進行下列操作。
1． 準備好50毫升新鮮真菌/酵母菌樣品
2． 在分光光度儀上測OD600＝1.0（1 OD＝1 X 107細胞/毫升；總量為5 X 108細胞）
3． 轉移到預冷的50毫升錐形離心管
4． 放進4℃臺式離心機離心10分鐘，速度為3000g
5． 小心抽去上清液
6． 加入25毫升清理液（Reagent A），混勻
7． 放進4℃臺式離心機離心10分鐘，速度為3000g
8． 小心抽去上清液
9． 加入5毫升平衡液（Reagent B），混勻
10． 放進4℃臺式離心機離心10分鐘，速度為3000g
11． 小心抽去上清液
12． 加入2毫升平衡液（Reagent B），混勻
13． 加入50微升酶解液（Reagent C），混勻
14． 放進30℃恒溫水槽孵育60分鐘，期間每隔15分鐘輕輕用手搖勻
15． 加入5毫升平衡液（Reagent B），混勻
16． 放進4℃臺式離心機離心10分鐘，速度為3000g
17． 小心抽去上清液
18． 加入5毫升平衡液（Reagent B），混勻
19． 放進30℃恒溫水槽孵育30分鐘，繼續實驗步驟21
20． 同時將平衡液（Reagent B）置入冰槽里預冷30分鐘（注意：以下步驟在4℃環境下進行）
21． 放進4℃臺式離心機離心10分鐘，速度為3000g
22． 小心抽去上清液
23． 加入5毫升預冷的平衡液（Reagent B），混勻
24． 放進4℃臺式離心機離心10分鐘，速度為3000g
25． 小心抽去上清液
26． 加入5毫升含有裂解液（Reagent D）和凈化液（Reagent E）的裂解工作液
27． 渦旋震蕩5秒，充分混勻細胞顆粒群
28． 選擇下列其中一種方法：
方法一：物理處理法
1． 即刻放進預冷的DOUNCE勻漿器
2． 在冰槽里用勻漿幫勻化細胞（約20下）（注意：參見注意事項10）
3． 將所有細胞勻漿物移入15毫升錐形離心管
4． 放進4℃臺式離心機離心10分鐘，速度為1500g
5． 小心移出上清液到另一個新的預冷的15毫升錐形離心管——此步驟去除細胞核和未溶解的細胞
6． 放進4℃臺式高速離心機離心10分鐘，速度為10000g
7． 小心抽去上清液，保留沉淀顆粒——此步驟獲得線粒體沉淀物
8． （選擇步驟）加入3毫升預冷的保存液（Reagent G）
9． （選擇步驟）放進4℃臺式高速離心機再次離心5分鐘，速度為10000g
10． （選擇步驟）小心抽去上清液
11． 加入1毫升保存液（Reagent G），充分混勻
12． 即刻移入1.5毫升離心管，放進－70℃冰箱里
方法二：化學處理法
1． 在冰槽里孵育2分鐘，期間渦旋震蕩5秒一次
2． 加入500微升預冷的強化液（Reagent F）
3． 渦旋震蕩5秒，充分混勻
4． 在冰槽里孵育5分鐘，期間渦旋震蕩5秒二次（注意：參見注意事項11）
5． 加入5毫升預冷的保存液（Reagent G），輕輕搖動試管混勻
6． 放進4℃臺式離心機離心10分鐘，速度為1500g
7． 小心移出上清液到另一個新的預冷的15毫升錐形離心管——此步驟去除細胞核和未溶解的細胞
8． 放進4℃臺式高速離心機離心10分鐘，速度為10000g
9． 小心抽去上清液，保留沉淀顆粒——此步驟獲得線粒體沉淀物
10． （選擇步驟）加入3毫升預冷的保存液（Reagent G）
11． （選擇步驟）放進4℃臺式高速離心機再次離心5分鐘，速度為10000g
12． （選擇步驟）小心抽去上清液
13． 加入1毫升保存液（Reagent G），充分混勻
14． 即刻移入1.5毫升離心管，放進－70℃冰箱里
注意事項
1． 本產品為10次操作（50毫升菌液：1克細胞濕重或5 X 108細胞）
2． 其它實際操作的細胞量與試劑使用量按比例調整：例如10毫升菌液（OD600=1）：試劑用量是標準用量的五分之一
3． 操作時，須戴手套
4． 操作時，避免污染母液
5． 50毫升（OD600＝1）菌液濕重約1克
6． 細胞生長條件影響線粒體的質量：建議在有氧條件下富含葡萄糖的培養基培養
7． 實驗步驟20以下的所有操作均須在4℃或以下狀態下進行
8． 建議使用足夠的細胞量
9． 建議嚴格控制操作時間
10． 通常勻化次數為20下（或細胞顆粒群消失為止）達到80％的細胞裂解為理想狀態，但不同菌株的細胞會存在差異。用戶可以通過顯微鏡觀察3微升勻漿物的細胞裂解程度：完整細胞呈現發亮的圓環。低于50％可以增加勻化次數
11． 通常孵育5分鐘達到80％的細胞裂解為理想狀態，但不同菌株的細胞會存在差異。用戶可以通過顯微鏡觀察3微升裂解物的細胞裂解程度：完整細胞呈現發亮的圓環。低于50％可以增加孵育時間和渦旋震蕩次數
12． 通常1克細胞濕重或5 X 108細胞的線粒體含量為50微克線粒體蛋白，但不同菌株或培養條件會存在差異；建議使用純化線粒體蛋白質濃度定量測定試劑盒（HL10059）測定線粒體蛋白濃度
13． 如果需要計量線粒體，稀釋后數分鐘內完成，否則線粒體將分解
14． 本產品所獲得的線粒體純度和產量尤為理想
15． 制備產物如果放在－70℃冰箱里儲存備用，嚴格避免反復凍融
16． 如果需要獲得95％以上純度的線粒體，使用真菌/酵母細胞線粒體分離（高純）試劑盒（HL10049.3）
17． 線粒體正常活性測定方法是： CITRATE SYNTHASE活性、氧化磷酸化、細胞色素吸收峰譜等
18． 線粒體內外膜完整性測定方法是：CYTOCHROME C OXIDASE活性和熒光JC染色
19． 本公司提供線粒體套餐：ROS、NAO、MitoTRACK、JGB、線粒體溶解等
20． 本公司提供系列真菌/酵母細胞線粒體試劑產品
質量標準
1． 本產品經鑒定性能穩定
2． 本產品經鑒定分離的線粒體內外膜完整
3． 本產品經鑒定分離的線粒體維持正常活性
4． 本產品經鑒定不含污染性蛋白酶和核酶