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小鼠血清、血浆及相关液体样本中C肽实验心得
阅读：1587 发布时间：2013-6-20小鼠血清、血浆及相关液体样本中C肽实验心得
实验心得一：实验步骤
1. 准备：从冰箱取出试剂盒，室温复温平衡30分钟。
2. 配液：用蒸馏水将20倍浓缩洗涤液稀释成原倍的洗涤液。
3. 加标准品和待测样本：取足够数量的酶标包被板，固定于框架上，分别设置标准品孔、待测样本孔和空白对照孔，记录各孔位置，在标准品孔中加入标准品50μL；待测样本孔中先加入待测样本10μL，再加样本稀释液40μL（即样本稀释5倍）；空白对照孔不加。
4. 温育：37℃水浴锅或恒温箱温育30min。
5. 洗板：弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液，静置1min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板4次（也可用洗板机按说明书操作洗板）。
6. 加酶标工作液：每孔加入酶标工作液50μL，空白对照孔不加。
7. 温育：37℃水浴锅或恒温箱温育30min。
8. 洗板：弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液，静置1min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板4次（也可用洗板机按说明书操作洗板）。
9. 显色：每孔先加入显色剂A 液50μL，再加入显色剂B液 50μL，平板混匀器混匀30s（或用手轻轻震荡混匀30s），37℃避光显色15min。
10. 终止：取出酶标板，每孔加终止液50μL，终止反应（颜色由蓝色立转黄色）。
11. 测定：以空白孔调零，在终止后15分钟内，用450nm波长测量各孔的吸光值（OD值）。
12. 计算：根据标准品的浓度及对应的OD值，计算出标准曲线的直线回归方程，再根据样本的OD值，在回归方程上计算出对应的样品浓度，也可以使用各种应用软件来计算。zui终浓度为实际测定浓度乘以稀释倍数。
实验心得二：注意事项
1. 样本不能含叠氮钠（NaN3），因为叠氮钠（NaN3）是辣根过氧化物酶（HRP）的抑制剂。
2. 标本采集后尽早进行提取，提取按相关文献进行，提取后应尽快进行实验。若不能立即试验，可将标本放于-20℃保存，但应避免反复冻融。
3. 样本应充分离心，不得有溶血及颗粒。
4. 实验严格按照说明书的操作进行，实验结果判定必须以酶标仪读数为准。
5. 酶标包被板开封后如未用完，应立即装入密封袋中加干燥剂保存。
6. 建议所有的标准品、样本和空白对照都做双份检测，取平均值，以减小实验误差。
7. 牢记样本已经稀释5倍，计算结果乘以5才是样本实际浓度。
8. 本试剂盒定量范围为62.5-2000pg/mL，超过此范围，为标准曲线延伸计算所得，不做为准确定量结果，请用特殊稀释液稀释后测定准确结果（62.5-2000pg/mL范围内），乘以总稀释倍数即为样本zui终浓度。
9. 若显色过浅，可适当延长底物温育时间。
10. 为避免交叉污染，标准品、样本和空白对照每加一个就要更换一次吸头；酶标工作液、样本稀释液和底物等公共组分，要悬臂加样，不得碰到微孔；不得重复使用封板膜。
11. 试剂盒保质期内使用，不同批号的试剂不得混用。
12. 底物B对光敏感，避免长时间暴露于光下。
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