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利用限制性核酸內(nèi)切酶切割DNA和利用DNA連接酶連接DNA是DNA重組過程中的關(guān)鍵步驟之一。成功的酶切和有效的連接為后續(xù)的外源基因進入宿主細胞進行表達提供了有效的實驗材料。
實驗方法
- 質(zhì)粒DNA酶切
- DNA段連接
| 實驗方法原理 | 限制性內(nèi)切酶能夠特異性地結(jié)合于一段被稱為限制性酶識別序列的DNA序列之內(nèi)或其附近的特異性位點上，并切割雙鏈DNA。 |
|---|---|
| 實驗材料 | 標準pUC19（2686bp） |
| 試劑、試劑盒 | EcoRI及其配套的酶切緩沖液 0.5×TBE電泳緩沖液 6×Loading Buffer Goldview 瓊脂糖 |
| 儀器、耗材 | 水平電泳儀 水浴鍋 移液器 微波爐 成像設(shè)備 |
| 實驗步驟 | 1.在200ul的離心管中，按照下表加入試劑（單位：ul），混勻；點動離心將反應(yīng)液甩至管底。37℃保溫2h進行酶切反應(yīng)。  2.反應(yīng)結(jié)束后，加入2ul 10×Loading Buffer鈍化酶活性；（或：65℃，保溫20min使酶失活）。 3.電泳檢測。 酶切陰性對照：pUC19標樣+10×Loading Buffer 2ul 酶切樣品：標準pUC19酶切樣品10ul + 10×Loading Buffer 2ul 4.質(zhì)粒及酶切樣品電泳預(yù)期結(jié)果。  |
| 注意事項 | 影響酶切的因素：在酶切反應(yīng)中，DNA的純度、緩沖液中的離子強度、Mg2+等因素均可影響反應(yīng)，一般可通過增加酶的用量，延長反應(yīng)時間等措施以達到*酶切。但應(yīng)注意的是，過多的酶量和過長的反應(yīng)時間會造成非特異性的酶切（星號活性） |
