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專題:細胞轉(zhuǎn)染操作方法

2013-7-8  閱讀(1639)

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轉(zhuǎn)染 ,是將外源性基因?qū)爰毎麅?nèi)的一種專門技術。隨著基因與蛋白功能研究的深入,轉(zhuǎn)染目前已成為實驗室工作中經(jīng)常涉及的基本方法。轉(zhuǎn)染大致可分為物理介導、化學介導和生物介導三類途徑。電穿孔法、顯微注射和基因槍屬于通過物理方法將基因?qū)爰毎姆独换瘜W介導方法很多,如經(jīng)典的磷酸鈣共沉淀法、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染方法、和多種陽離子物質(zhì)介導的技術;生物介導方法,有較為原始的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)染,和現(xiàn)在比較多見的各種病毒介導的轉(zhuǎn)染技術。

理想細胞轉(zhuǎn)染方法,應該具有轉(zhuǎn)染效率高、細胞毒性小等優(yōu)點。病毒介導的轉(zhuǎn)染技術,是目前轉(zhuǎn)染效率zui高的方法,同時具有細胞毒性很低的優(yōu)勢。但是,病毒轉(zhuǎn)染方法的準備程序復雜,常常對細胞類型有很強的選擇性,在一般實驗室中很難普及。其它物理和化學介導的轉(zhuǎn)染方法,則各有其特點。

需要指出的一點,無論采用哪種轉(zhuǎn)染技術,要獲得*的轉(zhuǎn)染結(jié)果,可能都需要對轉(zhuǎn)染條件進行優(yōu)化。影響轉(zhuǎn)染效率的因素很多,從細胞類型、細胞培養(yǎng)條件和細胞生長狀態(tài),到轉(zhuǎn)染方法的操作細節(jié),都需要考慮。

一、細胞傳代

1. 試驗準備:200ul/1mlTip頭各一盒(以上物品均需高壓滅菌),酒精棉球,廢液缸,試管架,微量移液器,記號筆,培養(yǎng)皿,離心管。

2. 棄掉培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)基,用1ml的PBS溶液洗滌兩次。

3. 用Tip頭加入1ml Trypsin液,消化1分鐘(37,5%CO2 )。用手輕拍培養(yǎng)瓶壁,觀察到細胞*從壁上脫落下來為止。

4. 加入1ml的含血清培養(yǎng)基終止反應。

5. 用Tip頭多次吹吸,使細胞*分散開。

6. 將培養(yǎng)液裝入離心管中,1000rpm離心5min。

7. 用培養(yǎng)液重懸細胞,細胞計數(shù)后選擇0.8X106個細胞加入一個35mm培養(yǎng)皿。

8. 將合適體積*培養(yǎng)液加入離心管中,混勻細胞后輕輕加入培養(yǎng)皿中,使其均勻分布。

9. 將培養(yǎng)皿轉(zhuǎn)入CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),第二天轉(zhuǎn)染。

二、細胞轉(zhuǎn)染

1. 轉(zhuǎn)染試劑的準備

① 將400ul去核酸酶水加入管中,震蕩10秒鐘,溶解脂狀物。

② 震蕩后將試劑放在-20攝氏度保存,使用前還需震蕩。

2. 選擇合適的混合比例(1:1-1:2/脂質(zhì)體體積:DNA質(zhì)量)來轉(zhuǎn)染細胞。在一個轉(zhuǎn)染管中加入合適體積的無血清培養(yǎng)基。加入合適質(zhì)量的MyoD或者EGFP的DNA,震蕩后在加入合適體積的轉(zhuǎn)染試劑,再次震蕩。

3. 將混合液在室溫放置10―15分鐘。

4. 吸去培養(yǎng)板中的培養(yǎng)基,用PBS或者無血清培養(yǎng)基清洗一次。

5. 加入混合液,將細胞放回培養(yǎng)箱中培養(yǎng)一個小時。

6. 到時后,根據(jù)細胞種類決定是否移除混合液,之后加入*培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24-48小時。

三、第二次細胞傳代

1. 在轉(zhuǎn)染后24小時,觀察實驗結(jié)果并記錄綠色熒光蛋白表達情況。

2. 再次進行細胞傳代,按照免疫染色合適的密度0.8X105個細胞/35mm培養(yǎng)皿將細胞重新轉(zhuǎn)入培養(yǎng)皿中。

3. 在正常條件下培養(yǎng)24小時后按照染色要求條件固定。

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