通用T載體菌落PCR鑒定試劑盒

通用T載體菌落PCR鑒定試劑盒 T4原理載體

目錄號：42015

試劑盒組成、儲存、穩(wěn)定性：

儲存：-20 ℃ 保存。

產(chǎn)品介紹：

菌落PCR鑒定是T載體克隆連接后鑒定是否有陽性克隆（含插入片段）zui方便快捷的方法。但是市面上能見到的菌落PCR鑒定試劑盒采用的都是T3,T7或者SP6等特異T載體引物，只能用于某種特定T載體連接陽性克隆的鑒定。如果使用不同T載體，便需同時購買多種鑒定試劑盒，大大增加了使用成本。本公司采用通用T載體引物研制的通用T載體菌落PCR鑒定試劑盒，只需購買一種試劑盒，便可用于市面上所有常見的T載體(包括pGEM，pUC，pBluescript系列) 連接陽性克隆的鑒定。此外，采用T3,T7或者SP6做引物的菌落PCR鑒定試劑盒引物距離插入位點的距離非常短，因此在鑒定100bp左右或者更小片段的插入時，陰性克隆的引物二聚體條帶和陽性克隆擴增條帶大小接近，無法區(qū)分。往往把引物二聚體的條帶看成是陽性擴增條帶，造成假陽性。反之，造成假陰性。本試劑盒通用T載體引物在未插入片段時的距離至少有150bp以上，加上插入片段的長度，可以清晰的區(qū)分是插入片段擴增出的條帶還是引物二聚體擴增出的條帶。避免假陽性或者假陰性，大大提高了準確性。本公司研發(fā)的一管便攜式PCR MasterMix預(yù)混系統(tǒng)，無需您一一加入各種成分，直接加入需篩選單菌落，經(jīng)過1小時左右的PCR反應(yīng)和電泳檢測即可得到重組菌落鑒定的結(jié)果。

預(yù)期擴增片段：

注意事項：

1.        重組菌落鑒定時，挑取單菌落前，應(yīng)先做好標記，便于鑒定后使用。

2.        挑取菌落時，應(yīng)選擇單菌落，不要挑取太多菌體，以免影響PCR結(jié)果。

3.        設(shè)定PCR 程序時，請根據(jù)插入片段大小決定延伸時間，如果插入片段大小為1 kb 以下，延伸時間30-45 秒即可，如果片段更長，可按此比例增加延伸時間。

操作步驟（以25ml體系舉例，客戶也可以采用20ml體系）：

{C}1.   按以下體系配好含有引物的1 x Taq MasterMix 反應(yīng)液。

2.  將過夜培養(yǎng)的平板上的菌落編號后，使用滅菌的槍頭挑取一部分單菌落加入上述反應(yīng)液，吹打混勻使菌落充分分散到反應(yīng)液中。

可多設(shè)置一管不加菌落的陰性對照，以便于分析實驗結(jié)果。

3.  將PCR管置于熱循環(huán)儀上按以下條件開始反應(yīng)，建議條件如下：

94℃ 10 min

94℃ 30 sec

55℃ 30 sec        30-33 cycles

72℃ 0.5-1 min

72℃ 5 min

注意：延伸時間請根據(jù)插入片段大小調(diào)整。預(yù)變性時間延長到10分鐘，主要是為了裂解菌落，釋放DNA模板。

反應(yīng)結(jié)束后，取5-10ml直接上樣電泳檢測。

注：如果細菌難裂解或者雜質(zhì)多假陰性，嘗試下面的方法，裂解釋放DNA后進行。

1.        挑取菌落加入 50ml dd水 （或者10ml dd水中），振搖。

2.        99度，10分鐘滅活菌液中的酶，并釋放DNA。

3.        12000rpm離心1分鐘去除細胞碎片。

4.        取上清PCR，25ml PCR體系取5ml上清（起始50ml dd水），或者1ml上清（起始10ml dd水）做模板。

通用T載體菌落PCR鑒定試劑盒 T4原理載體