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抚生试剂-核酸扩增工艺的优化和质量控制工艺优化
阅读：163 发布时间：2014-4-11核酸扩增工艺的优化和质量控制工艺优化
核酸扩增工艺在整个核酸检测试剂中zui重要，其涉及的试剂及原材料多，反应参数设定复杂，是整个检测反应的核心。具体包括检测试剂的配制与反应参数的设置。其中检测试剂主要由以下组分组成：引物、探针、Taq酶、UNG酶等；反应参数包括引物与探针浓度、*Tm值、信号采集温度等。以HIV-1荧光定量PCR检测试剂为例进行说明。
工艺优化
1．引物探针的设计与优化
引物探针的设计与质量控制见前面*节，根据保守的靶序列，按照HIV引物探针设计的要求设计几对引物和探针，从中进行优化选择。
将这几对引物及探针系统经过网上数据库比对，显示须为HIV-1特异序列。对HIV全基因组克隆质粒系列稀释物进行检测，能够检测到10个分子/PCR反应引物探针系统为待选的引物探针系统。将待选的引物探针系统对临床血清样本进行检测，应具有较好的特异性与敏感性，同时应对HAV、HBV、HCV及DFV等的核酸检测无交叉反应。
2．反应参数的优化
将HIV靶序列RT-PCR产物克隆到T载体上，酶切线形化后稀释成不同浓度的样本，从引物浓度、荧光探针浓度和PCR循环参数几个方面进行反应参数的选定。
1)反应参数的确定：根据引物Tm值、产物大小在梯度PCR仪上进行不同延伸温度的测定，根据zui适的延伸温度确定*荧光信号采集温度。
2)引物、探针浓度的确定：不同浓度引物、探针组合后对系列稀释的病毒RNA检测，以确定zui适的引物、探针浓度。
3．防污染的优化
扩增的产物污染引致的PCR假阳性是PCR实验污染的主要来源，可用UNG-dUTP系统有效去除，具体过程为：扩增底物中以脱氧尿嘧啶三磷酸核苷酸(dUTP)取代脱氧胸腺嘧啶三磷酸核苷酸(dTTP)，故产物中含尿嘧啶核苷(du)后续扩增之前，在PCR体系中加入能分解dU的尿嘧啶糖苷酶(UNG)，在预变性加热时，若体系中存在前一次扩增产物的污染，污染物中所有的dU处均被UNG酶解断裂，不可能作为下一次扩增的模板，从而达到消除污染的目的。