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RT-PCR反轉(zhuǎn)錄酶與合成 cDNA 引物的選擇
閱讀：191 發(fā)布時間：2024-12-9逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng) (Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction，RT-PCR) 的原理是：提取組織或細(xì)胞中的總 RNA，以其中的 mRNA 作為模板，采用 Oligo（dT） 或隨機(jī)引物利用逆轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄成 cDNA。再以 cDNA 為模板進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，而獲得目的 基因或檢測基因表達(dá)。RT-PCR 使 RNA 檢測的靈敏性提高了幾個數(shù)量級，使一些極為微量 RNA 樣品分析成為可能。
一、反轉(zhuǎn)錄酶的選擇
1． Money 鼠白血病病毒（MMLV）反轉(zhuǎn)錄酶：有強(qiáng)的聚合酶活性，RNA 酶 H 活性相對 較弱。最適作用溫度為 37℃。
2．禽成髓細(xì)胞瘤病毒（AMV）反轉(zhuǎn)錄酶：有強(qiáng)的聚合酶活性和 RNA 酶 H 活性。最適作用 溫度為 42℃。
3．Thermus thermophilus、Thermus flavus 等嗜熱微生物的熱穩(wěn)定性反轉(zhuǎn)錄酶：在 Mn2+存在下，允許高溫反轉(zhuǎn)錄 RNA，以消除 RNA 模板的二級結(jié)構(gòu)。
4．MMLV 反轉(zhuǎn)錄酶的 RNase H-突變體：商品名為 Superscript 和 SuperScriptⅡ。此種 酶較其它酶能多將更大部分的 RNA 轉(zhuǎn)換成 cDNA，這一特性允許從含二級結(jié)構(gòu)的、低溫反 轉(zhuǎn)錄很困難的 mRNA 模板合成較長 cDNA。
二、合成 cDNA 引物的選擇
1． 隨機(jī)六聚體引物：當(dāng)特定 mRNA 由于含有使反轉(zhuǎn)錄酶終止的序列而難于拷貝其全長序列時，可采用隨機(jī)六聚體引物這一不特異的引物來拷貝全長 mRNA。用此種方法時，體 系中所有 RNA 分子全部充當(dāng)了 cDNA 第一鏈模板，PCR 引物在擴(kuò)增過程中賦予所需要的 特異性。通常用此引物合成的 cDNA 中 96%來源于 rRNA。
2． Oligo(dT)：是一種對 mRNA 特異的方法。因絕大多數(shù)真核細(xì)胞 mRNA 具有 3’端 Poly(A+)尾，此引物與其配對，僅 mRNA 可被轉(zhuǎn)錄。由于 Poly(A+)RNA 僅占總 RNA 的 1-4%，故此種引物合成的 cDNA 比隨機(jī)六聚體作為引物和得到的 cDNA 在數(shù)量和復(fù)雜性 方面均要小。
3． 特異性引物：最特異的引發(fā)方法是用含目標(biāo) RNA 的互補序列的寡核苷酸作為引物， 若 PCR 反應(yīng)用二種特異性引物，第一條鏈的合成可由與 mRNA 3’端最靠近的配對引物起 始。用此類引物僅產(chǎn)生所需要的 cDNA，導(dǎo)致更為特異的 PCR 擴(kuò)增。