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熒光定量PCR(SYBR Green)總RNA提取方法步驟
閱讀：419 發(fā)布時(shí)間：2023-12-4總RNA提?。?/strong>
A組織樣本：迅速將新鮮的組織切成合適的大小，在液氮中充分研磨后加裂解液裂解，或直接加入裂解液后用勻漿器勻漿。每30-50mg組織加1ml Trizol。
B全血樣品：加入3-5倍體積的紅細(xì)胞裂解液到血樣中，室溫孵育10min，室溫3500rpm離心6min。棄上清，原每2-3ml全血樣品加1mL Trizol。
C細(xì)胞樣品：懸浮液中生長(zhǎng)的細(xì)胞，通過離心收集細(xì)胞后，每1×105?106細(xì)胞加入1mL Trizol，移液器吹打混勻，直接裂解或-80℃儲(chǔ)存一個(gè)月。貼壁生長(zhǎng)的細(xì)胞，有兩種處理方法。一種是移除培養(yǎng)基后，將1mL Trizol直接加入直徑3.5cm的培養(yǎng)皿中裂解細(xì)胞。或是先用胰蛋白酶將貼壁細(xì)胞消化下來(lái)并收集后，再加入1mL Trizol進(jìn)行裂解。（Note：加入Trizol前, PBS充分洗滌細(xì)胞去除殘余培養(yǎng)基。）熒光定量PCR(SYBR Green)總RNA提取方法步驟如下：
1、直接法
1）加入1ml Trizol試劑，混勻，冰上孵育10min。
2）4℃，12000rpm離心10min，小心轉(zhuǎn)移上清液到不含顆粒的新EP管中。
3）加入200ul氯仿，劇烈振蕩15秒，室溫孵育5min。
4）4℃，12000rpm離心15min。混合液分三層，包括最下面的苯酚 - 氯仿有機(jī)相，中間相和上層水相。小心轉(zhuǎn)移上層水相到新的EP管（大約60％體積的Trizol），不要吸取中間相，可留下少量上層液體?。∟ote：質(zhì)量比數(shù)量更重要?。?/span>
5）加入等體積的異丙醇，輕輕地顛倒混勻約10次，室溫放置10min。
6）4℃，12000rpm離心10min。棄上清，1ml 75％乙醇洗滌RNA沉淀兩次。
7）4℃，12000rpm離心5min，棄上清，室溫下風(fēng)干5-10min（不要太干，過度干燥會(huì)導(dǎo)致RNA難溶解?。NA溶于15μl-50μlDEPC水中。
8）立即進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，或先-80℃長(zhǎng)期保存。
2、離心柱法(依據(jù)RNA提取試劑盒說(shuō)明書)
1）1、中步驟1）—4）。
2）加入1/2體積的無(wú)水乙醇，輕柔顛倒混勻。如有透明的纖維狀物體，不影響下游步驟。
3）將所有裂解物/乙醇混合物轉(zhuǎn)移至離心柱，置于2mL，靜置2min。4℃，12000rpm離心3min，棄廢液。
4）加入500uL洗滌液，靜置2min。4℃，12000rpm離心30秒，棄廢液。重復(fù)一次。
5）4℃，10,000rpm離心2min以除去殘留的乙醇。
6）將離心柱置于新的RNase-free EP管中，加入30ul-50ulDEPC水，靜置5min， 12000rpm離心2min收集。
7）立即進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，或先-80℃長(zhǎng)期保存。