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利用血清篩選噬菌體文庫交叉抑制實驗

2013-3-16  閱讀(1489)

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[器材和試劑]
● 多孔板(Immuno plate Maxisorp,Nuno)
● TBS
● PEG—純化噬菌體
● PBST
● 封閉液(含5%脫脂牛奶,0.05%Tween—20,0.02%NaN3的PBS)
● XLl—Blue細菌提取物
● 堿性磷酸酶標記的羊抗人IgG(Fc特異性)抗體(Sigma)
● 底物緩沖液(10%二乙醇胺,0.5mmmol/L Mg-2,0.05%NaN3, 用HCl調(diào)節(jié)至pH 9.8)
● 顯色液(在底物緩沖液中加1mg/ml p硝基苯磷酸)
● 自動酶標儀

[方法]
1.將100ul含有2 ×1010個PEG—純化噬菌體顆粒的TBS,等量分加到多孔板各孔中,4℃孵育12小時。
2.用PBST洗滌數(shù)次,在室溫下每孔加250/ll封閉液封閉2小時。
3.用封閉液稀釋血清,其中含1×1010個/mlMl3噬菌體顆粒、50ul/ml的XLl—Blue細菌提取物以及2×1011個顆粒/ml PEG純化抑制子噬菌??寺?, 室溫預(yù)孵育3小時。
4.除去板中封閉液,將預(yù)孵育的血清混合物加到噬菌體包被孔中,并在室溫下孵育3小時。
5.用PBST充分洗滌。
6.每孔加100ul堿性磷酸酶標記二抗,用封閉液按l:5000比例稀釋,并在室溫下孵育2小時。
7,用PBST洗板數(shù)次,用底物緩沖液洗滌一次。
8.每孔加入100ul含lmg/ml p硝基苯磷酸的底物緩沖液,以顯示堿性磷酸酶反應(yīng)。

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