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cDNA*鏈的合成

2013-3-9  閱讀(1504)

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[方法]
1.為合成cDNA*鏈,在1個1.5ml硅化微量離心管中制備以下反應(yīng)混合液,
● 10-RT緩沖液,5ul
● 20×dNTP, 5ul
● 100mmol/LDTT, 5ul
● Hu IgMFOR引物,2ul
● HuCκFOR引物, 2ul
● HuCλFOR引物, 2ul
● RNAsin,80U(2ul)
● 所有引物濃度均為10pmol/ul
2.取整數(shù)體積(1~4ug)存于乙醇中的RNA,放在1個無菌1.5ml微量離心管內(nèi),并用微型離心機離心5分鐘。 用70%乙醇洗滌沉淀1次, 晾干, 并用24.5ul DEPC重懸。
3.將溶液加熱到65℃持續(xù)3分鐘,使RNA變性;冰上放置2分鐘冷卻,并加入到*鏈反應(yīng)混合液中。加入2.5ul AMV反轉(zhuǎn)錄酶,42℃孵育1小時。
4.煮沸cDNA混合反應(yīng)液,3分鐘。用微型離心機離心5分鐘。將含有cDNA的上清液轉(zhuǎn)移至新的硅化管內(nèi),并用它盡快進行V基因的PCR擴增。

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