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用PCR識別不同的噬菌體抗體克隆

2013-3-5  閱讀(1716)

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[方法]
1.配制PCR“主混合液”,每克隆20ul PCR混合液, 包含:
● 水,15.5ul
● 10XRT緩沖液,2.0ul
● 5mmol/L dNTP, 1.0ul
● 5,引物,1.0ul
● 3,引物,1.0ul
● Taq聚合酶,0.2ul
如果PCR緩沖液中不含Mg2+,這應(yīng)加至終濃度為1.5mmol/L。也可以使用與DNA聚合酶配套供應(yīng)的PCR試劑。
2.取20fLl主混合液加到0.5m1管內(nèi),或加入96孔PCR微孔板孔內(nèi)。
3.用l根牙簽輕輕接觸單個(gè)克隆并在PCR反應(yīng)液中轉(zhuǎn)動(dòng),注意不要轉(zhuǎn)移太多材料。如在PCR反應(yīng)液中有過量細(xì)菌,會(huì)抑制PCR反應(yīng)。扔掉牙簽;或如有需要,用它在1個(gè)單獨(dú)的96孔培養(yǎng)孔板內(nèi)培養(yǎng)基救援該克隆;或者在瓊脂平板上接觸表面。用1~2ul甘油儲存料或主板培養(yǎng)液,也可以代替相應(yīng)克隆。
4.反應(yīng)液上鋪上礦物油。
5.用PCR儀格內(nèi)加熱試管或孔板至94℃,10分鐘。裂解細(xì)菌使其釋放模板DNA。然后,以94℃1分鐘、55~60℃1分鐘(對于Fab片段文庫的篩選則為2分鐘)、72℃ 1分鐘的條件孵育,共循環(huán)30次。
6.建議在PCR后取5ul PCR反應(yīng)產(chǎn)物在2%瓊脂糖膠上檢測。這將顯示有多少克隆包含全長的插入序列。
7.PCR后,在礦物油下面加入20ul主混合液,成分如下:
● 乙?;疊SA(10mg/ml), 0.2ul
● BstNⅠ緩沖液(10×),4.0ul
● 水,15.3ul
● BstNⅠ (10U/ul),0.54ul
8.60℃孵育樣本2~3小時(shí)。
9.將2ul樣本染液與8ul反應(yīng)混合物(取自礦物油下面)混合并在4%Nusieve瓊脂糖膠上電泳;此膠用含0.05ug/ml溴化乙錠的0.5倍TBE緩沖液配制?;蛘呤怯?.5%瓊脂糖膠電泳(此膠的分辨率較低)。
10.以100V(10V/cm)跑膠并在UV transillu minator上比較各種不同的單獨(dú)克隆的帶型。

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