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借助于噬菌體ELISA的DNA/RNA結(jié)合活性的分析方法

2012-12-15  閱讀(1399)

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A.噬菌體的制備
1.挑取含有源自文庫篩選的噬菌體克隆的單菌落。用滅菌牙簽挑取單菌落接種于滅菌圓底培養(yǎng)板的微孔內(nèi),其中加有150ul含15ug/ml的四環(huán)素的2×TY培養(yǎng)基。用一個(gè)微孔培養(yǎng)展示野生型DNA/RNA結(jié)合區(qū)域的噬菌體,作為陽性對照。以250r/min的速度小心振蕩微孔板,30℃培養(yǎng)16小時(shí)。
2.在合適的吊斗式離心機(jī)中3700g離心96孔培養(yǎng)板15分鐘,以制備噬菌體上清液。將上清液轉(zhuǎn)移到一個(gè)新的微孔板內(nèi),4℃保存。

B.噬菌體ELISA
1,將生物素聯(lián)結(jié)的核酸靶標(biāo)位點(diǎn)(通常是0~5pmol之間,稀釋于50ul PBS緩沖液中)加入鏈親和素包被的微孔板內(nèi)。對于陽性對照,將適量的野生型結(jié)合位點(diǎn)加入一個(gè)微孔內(nèi)。用一個(gè)只含PBS緩沖液的微孔作為陰性對照,以測定ELISA的本底。將微孔板于20℃放置15分鐘。
2.每孔加入150gl含有4%(w/v)脫脂牛奶的PBS緩沖液作為封閉劑。將微孔板于20℃放置1小時(shí)。
3,將噬菌體上清液(得自步驟A2)1;10稀釋于lml含有2%(w/v)脫脂牛奶、1%(體積分?jǐn)?shù))Tween-20及20ug/ml的超聲破碎的鮭魚精DNA的PBS緩沖液中。
4.將核酸包被的微孔中的封閉液棄去,加入50ul稀釋過的噬茵體上清液。將微孔板于20℃放置l小時(shí)。
5.將結(jié)合液棄去,用200ul含1%(體積分?jǐn)?shù))Tween—20的PBS緩沖液洗滌7次,再用PBS緩沖液單獨(dú)洗滌3次。
6.將HRP聯(lián)結(jié)的抗M131gG抗體用含有2%(w/v)脫脂牛奶的PBS緩沖液作l:5000稀釋,然后每孔加入50g1。20℃放置l小時(shí)。
7.將抗體結(jié)合液棄去,用200ul含0.05%(體積分?jǐn)?shù))Tween—20的PBS緩沖液洗滌3次,再用PBS緩沖液單獨(dú)洗滌3次。
8.加入100ul HRP底物液,如上文所述的基于TMB的顯色液,使ELISA顯色。約5分鐘后終止顯色反應(yīng),如使用TMB,則加入100ul 1 mol/L的硫酸。立即用酶標(biāo)儀測定ELISA數(shù)值。
9.要評估篩選出的結(jié)合區(qū)域的特異性序列的結(jié)合性,將它們的ELISA數(shù)值與陽性對照孔和陰性對照孔的數(shù)值進(jìn)行比較。

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