基因克隆

一.目的基因的獲得

目的基因是指所要研究或應(yīng)用的基因,也就是將要克隆或表達的基因。獲得目的基因是分子克隆過程中重要的一步。目前用于獲得目的基因的方法有幾種，如限制性內(nèi)切酶直接分離法、文庫篩選法、體外擴增法和人工合成法等，其中限制性內(nèi)切酶法直接分離目的基因和多聚酶鏈式反應(yīng)(PCR) 或逆轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈式反應(yīng)(RT-PCR) 體外擴增目的DNA--片段是目前常用的方法。

(一)采用限制性酶切法直接分離目的基因

1、從原核基因組中制備原核基因組相對較小，用幾種限制性內(nèi)切酶分別消化原核基因組，或用某種限制性內(nèi)切酶對所要研究的基因組進行部分消化，可以得到大小不等的各種片段，其中有些片段就會含有目的基因，將這些片段插入載體中進行克隆，經(jīng)過篩選，可以得到所需的目的基因。

2.從真核基因組中制備真核基因組比較大，直接用限制性內(nèi)切酶消化后需要篩選的克隆數(shù)太多，不易操作?？梢杂靡环N限制性內(nèi)切酶先消化基因組DNA,產(chǎn)生連續(xù)的DNA--片段，然后電泳分離這些DNA--片段，再用-段特異探針與這些DNA--片段進行雜交，在含有特異性模板的區(qū)域就會出現(xiàn)雜交帶，可以初步鑒定基因組中是否含有目的基因。我們也可以將酶切后的基因組DNA--片段全部克隆入適當?shù)妮d體中，制成基因組文庫，再用特異性探針與基因組文庫中的不同克隆進行雜交，陽性克隆即示克隆到的DNA--片段含有特異基因序列。將陽性克隆測序，用第--個克隆片段的末端分離下一個克隆片段，然后利用DNA--片段間的重疊順序來鑒定其他克隆。這樣一步步走下去，終可得全部基因序列，這種技術(shù)叫做染色體步移(chromosome walking)。

(二)采用PCR或RT-PCR方法制備目的基因

1.根據(jù)已發(fā)表的基因序列設(shè)計并合成引物，采用PCR (以基因組DNA為模板)或RT-PCR (以mRNA為模板)從組織或細胞中獲取目的基因片段用于基因操作，這是實驗室中常用的獲取已知基因的方法。

2.利用PCR獲取目的基因的一大優(yōu)點就是可以根據(jù)需要在引物序列上設(shè)計適當?shù)拿盖形稽c起始密碼子或終止密碼子等，或通過人為錯配改變堿基序列(人工突變)對目的基因進行有限修飾。對于未知基因，可采取構(gòu)建RT-PCR文庫的方法獲得未知基因:利用mRNA末端poly A序列尾設(shè)計共用引物，將所有mRNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA.利用各種工具酶在cDNA末端加尾,然后采用一對共用引物擴增所有cDNA--片段，將經(jīng)PCR擴增后的片段插入到適當載體中，構(gòu)建成PCR-CDNA文庫。這種方法的優(yōu)點是可以將表達水平很低的mRNA擴增出來，有利于篩選出表達豐度低的基因。由于經(jīng)過PCR擴增，基因序列的精que確性需要采用其他方法進一步確定。

3.還有一個獲得目的基因的方法是利用計算機技術(shù)進行計算機克隆。即利用GenBank中的基因信息，通過軟件比較不同種屬基因之間的相似性(同源性)，利用保守區(qū)序列設(shè)計引物， 再用PCR或RT-PCR從不同種屬或不同組織細胞中獲取未知的基因片段。這是目前可實現(xiàn)的一種獲得新基因的捷徑。

(三)基因組文庫或cDNA文庫的構(gòu)建和篩選

1.將基因組DNA用限制性內(nèi)切酶消化后插入到適當載體中，得到含有不同插入片段的克隆載體，這種克隆載體的混合物含有長短不同的基因組片段，這就是基因文庫。若將細胞內(nèi)所有mRNA均逆轉(zhuǎn)錄成cDNA,然后將所有cDNA--片段克隆到適當?shù)妮d體中，構(gòu)建成含有不同cDNA--片段的克隆載體混合物，這就是cDNA文庫。目前許多組織或細胞的基因組或cDNA文庫都可以從商業(yè)公司買到。

2.當獲得了基因組文庫或cDNA文庫，可以根據(jù)已知的信息合成特異性探針，采用核酸分子雜交的方法從文庫中篩選感興趣的基因片段，這仍是目前獲得新基因的一種常用手段?；蚪M文庫或cDNA文庫的構(gòu)建和使用請參見本書相應(yīng)的章節(jié)。

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