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普通PCR的操作步驟
閱讀：1324 發(fā)布時(shí)間：2023-7-28
一般的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)由20到35個(gè)循環(huán)組成，每個(gè)循環(huán)包括以下3個(gè)步驟：
變性：利用高溫（94℃～98℃）使雙鏈DNA分離。高溫將連接兩條DNA鏈的氫鍵打斷。在第一個(gè)循環(huán)之前，通常加熱長一些時(shí)間以確保模板和引物 全分離，僅以單鏈形式存在。該步驟時(shí)間1～2分鐘，接下來機(jī)器就控制溫度進(jìn)入循環(huán)階段。
退火（又稱復(fù)性、降溫貼合、緩冷配對、引物黏合）：在DNA雙鏈分離后，降低溫度使得引物可以結(jié)合于單鏈DNA上。此階段的溫度通常低于引物熔點(diǎn)5℃。錯(cuò)誤的退火溫度可能導(dǎo)致引物不與模板結(jié)合或者錯(cuò)誤地結(jié)合。該步驟時(shí)間1～2分鐘。新技術(shù)的融合型核酸聚合酶在此階段的溫度會高于熔點(diǎn)3~5℃，僅需時(shí)間5~10秒。
延伸：DNA聚合酶由降溫時(shí)結(jié)合上的引物開始沿著DNA鏈合成互補(bǔ)鏈。此階段的溫度依賴于DNA聚合酶。該步驟時(shí)間依賴于聚合酶以及需要合成的DNA片段長度。傳統(tǒng)的Taq估計(jì)合成1000 bp大概需要1分鐘、較新的Tbr（來自于嗜熱菌Thermus brockianus）約40秒、商業(yè)公司生產(chǎn)的融合型聚合酶僅需約10-15秒。有修正功能的則會比較慢。
3 PCR反應(yīng)體系
表1 標(biāo)準(zhǔn)的PCR反應(yīng)體系
4 PCR反應(yīng)特點(diǎn)
4.1特異性強(qiáng)
PCR反應(yīng)的特異性決定因素為：
①引物與模板DNA特異正確的結(jié)合；
②堿基配對原則；
③Taq DNA聚合酶合成反應(yīng)的忠實(shí)性；
④靶基因的特異性與保守性。
4.2 靈敏度高
PCR產(chǎn)物的生成量是以指數(shù)方式增加的，能將皮克(pg=10-12)量級的起始待測模板擴(kuò)增到微克(μg=10-6)水平。能從100萬個(gè)細(xì)胞中檢出一個(gè)靶細(xì)胞；在病毒的檢測中，PCR的靈敏度可達(dá)3個(gè)RFU(空斑形成單位)；在細(xì)菌學(xué)中最小檢出率為3個(gè)細(xì)菌。
4.3簡便、快速
PCR反應(yīng)用耐高溫的Taq DNA聚合酶，一次性地將反應(yīng)液加好后，經(jīng)過變性-退火-延伸反應(yīng)，一般在2～4 小時(shí)完成擴(kuò)增反應(yīng)。擴(kuò)增產(chǎn)物一般用電泳分析，不一定要用同位素，無放射性污染、易推廣。
4.4 對標(biāo)本的純度要求低
不需要分離病毒或細(xì)菌及培養(yǎng)細(xì)胞，DNA粗制品及RNA均可作為擴(kuò)增模板。可直接用臨床標(biāo)本如血液、體腔液、洗嗽液、毛發(fā)、細(xì)胞、活組織等DNA擴(kuò)增檢測。
5 PCR常見問題
5.1假陰性，不出現(xiàn)擴(kuò)增條帶
PCR反應(yīng)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)有：
（1）模板核酸的制備
①模板中含有雜蛋白質(zhì)；
②模板中含有Taq酶抑制劑；
③模板中蛋白質(zhì)沒有消 化除凈，特別是染色體中的組蛋白；
④在提取制備模板時(shí)丟失過多，或吸入酚；
⑤模板核酸變性不 底。在酶和引物質(zhì)量好時(shí)，不出現(xiàn)擴(kuò)增帶，極有可能是標(biāo)本
的消化處理，模板核酸提取過程出了毛病，因而要配制有效而穩(wěn)定的消化處理液，
其程序亦應(yīng)固定不宜隨意更改。
（2）引物的質(zhì)量與特異性
引物質(zhì)量、引物的濃度、兩條引物的濃度是否對稱，是PCR失敗或擴(kuò)增條
帶不理想、容易彌散的常見原因。有些批號的引物合成質(zhì)量有問題，兩條引物一
條濃度高，一條濃度低，造成低效率的不對稱擴(kuò)增，對策為：
①選定一個(gè)好的引物合成單位。
②引物的濃度不僅要看OD值，更要注重引物原液做瓊脂糖凝膠電泳，一定要有
引物條帶出現(xiàn)，而且兩引物帶的亮度應(yīng)大體一致，如一條引物有條帶，一條引物
無條帶，此時(shí)做PCR有可能失敗，應(yīng)和引物合成單位協(xié)商解決。如一條引物亮度
高，一條亮度低，在稀釋引物時(shí)要平衡其濃度。
③引物應(yīng)高濃度小量分裝保存，防止多次凍融或長期放冰箱冷藏部分，導(dǎo)致引物
變質(zhì)降解失效。
④引物設(shè)計(jì)不合理，如引物長度不夠，引物之間形成二聚體等。
（3）酶的質(zhì)量
酶失活：需更換新酶，或新舊兩種酶同時(shí)使用，以分析是否因酶的活性喪失或不夠而導(dǎo)致假陰性。需注意的是有時(shí)忘加Taq酶或溴乙錠。
（4）Mg2+濃度
Mg2+離子濃度對PCR擴(kuò)增效率影響很大，濃度過高可降低PCR擴(kuò)增的特異
性，濃度過低則影響PCR擴(kuò)增產(chǎn)量甚至使PCR擴(kuò)增失敗而不出擴(kuò)增條帶。
（5）反應(yīng)體積的改變
通常進(jìn)行PCR擴(kuò)增采用的體積為20ul、30ul、50ul或100ul，應(yīng)用多大體積
進(jìn)行PCR擴(kuò)增，是根據(jù)科研和臨床檢測不同目的而設(shè)定，在做小體積如20ul 后，
再做大體積時(shí)，一定要模索條件，否則容易失敗。
（6）物理原因
變性對PCR擴(kuò)增來說相當(dāng)重要，如變性溫度低，變性時(shí)間短，極有可能出現(xiàn)
假陰性；退火溫度過低，可致非特異性擴(kuò)增而降低特異性擴(kuò)增效率退火溫度過高
影響引物與模板的結(jié)合而降低PCR擴(kuò)增效率。有時(shí)還有必要用標(biāo)準(zhǔn)的溫度計(jì)，檢
測一下擴(kuò)增儀或水溶鍋內(nèi)的變性、退火和延伸溫度，這也是PCR失敗的原因之一。
（7）靶序列變異
如靶序列發(fā)生突變或缺失，影響引物與模板特異性結(jié)合，或因靶序列某段缺
失使引物與模板失去互補(bǔ)序列，其PCR擴(kuò)增是不會成功的。
5.2 假陽性
出現(xiàn)的PCR擴(kuò)增條帶與目的靶序列條帶一致，有時(shí)其條帶更整齊，亮度更高。
（1）引物設(shè)計(jì)不合適
選擇的擴(kuò)增序列與非目的擴(kuò)增序列有同源性，因而在進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)，
擴(kuò)增出的PCR產(chǎn)物為非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出現(xiàn)假
陽性。需重新設(shè)計(jì)引物。
（2）靶序列或擴(kuò)增產(chǎn)物的交叉污染
這種污染有兩種原因：一是整個(gè)基因組或大片段的交叉污染，導(dǎo)致假陽性。
這種假陽性可用以下方法解決：操作時(shí)應(yīng)小心輕柔，防止將靶序列吸入加樣槍
內(nèi)或?yàn)R出離心管外。除酶及不能耐高溫的物質(zhì)外，所有試劑或器材均應(yīng)高壓消
毒。所用離心管及樣進(jìn)槍頭等均應(yīng)一次性使用。必要時(shí)，在加標(biāo)本前，反應(yīng)管
和試劑用紫外線照射，以破壞存在的核酸。二是空氣中的小片段核酸污染，這
些小片段比靶序列短，但有一定的同源性?？苫ハ嗥唇樱c引物互補(bǔ)后，可擴(kuò)
非特異性條帶的出現(xiàn)，其原因：一是引物與靶序列不完 互補(bǔ)、 或引物聚合形成二聚體。二是Mg2+離子濃度過高、退火溫度過低，及PCR循環(huán)次數(shù)過多有關(guān)。其次是酶的質(zhì)和量，往往一些來源的酶易出現(xiàn)非特異條帶而另一來源的酶則不出現(xiàn)，酶量過多有時(shí)也會出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增。對策有：
①必要時(shí)重新設(shè)計(jì)引物；
②減低酶量或調(diào)換另一來源的酶；
③降低引物量，適當(dāng)增加模板量，減少循環(huán)次數(shù)；
④適當(dāng)提高退火溫度或采用二溫度點(diǎn)法(93℃變性，65℃左右退火與延伸)。
5.4出現(xiàn)片狀拖帶或涂抹帶
PCR擴(kuò)增有時(shí)出現(xiàn)涂抹帶或片狀帶或地毯樣帶。其原因往往由于酶量過多或酶的質(zhì)量差，dNTP濃度過高，Mg2+濃度過高，退火溫度過低，循環(huán)次數(shù)過多引起。對策為：
①減少酶量，或調(diào)換另一來源的酶。
②減少dNTP的濃度。適當(dāng)降低Mg2+濃度。增加模板量，減少循環(huán)次數(shù)。
| 組分 | 用量 |
| 10×擴(kuò)增緩沖液 | 10μl |
| 4種dNTP混合物 | 200μl |
| 引物 | 10～100μl |
| 模板DNA | 0.1～2μg |
| Taq DNA聚合酶 | 2.5 μl |
| Mg2+ | 1.5mmol/L |
| 加雙蒸水 | 100 μl |
4 PCR反應(yīng)特點(diǎn)
4.1特異性強(qiáng)
PCR反應(yīng)的特異性決定因素為：
①引物與模板DNA特異正確的結(jié)合；
②堿基配對原則；
③Taq DNA聚合酶合成反應(yīng)的忠實(shí)性；
④靶基因的特異性與保守性。
4.2 靈敏度高
PCR產(chǎn)物的生成量是以指數(shù)方式增加的，能將皮克(pg=10-12)量級的起始待測模板擴(kuò)增到微克(μg=10-6)水平。能從100萬個(gè)細(xì)胞中檢出一個(gè)靶細(xì)胞；在病毒的檢測中，PCR的靈敏度可達(dá)3個(gè)RFU(空斑形成單位)；在細(xì)菌學(xué)中最小檢出率為3個(gè)細(xì)菌。
4.3簡便、快速
PCR反應(yīng)用耐高溫的Taq DNA聚合酶，一次性地將反應(yīng)液加好后，經(jīng)過變性-退火-延伸反應(yīng)，一般在2～4 小時(shí)完成擴(kuò)增反應(yīng)。擴(kuò)增產(chǎn)物一般用電泳分析，不一定要用同位素，無放射性污染、易推廣。
4.4 對標(biāo)本的純度要求低
不需要分離病毒或細(xì)菌及培養(yǎng)細(xì)胞，DNA粗制品及RNA均可作為擴(kuò)增模板。可直接用臨床標(biāo)本如血液、體腔液、洗嗽液、毛發(fā)、細(xì)胞、活組織等DNA擴(kuò)增檢測。
5 PCR常見問題
5.1假陰性，不出現(xiàn)擴(kuò)增條帶
PCR反應(yīng)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)有：
（1）模板核酸的制備
①模板中含有雜蛋白質(zhì)；
②模板中含有Taq酶抑制劑；
③模板中蛋白質(zhì)沒有消 化除凈，特別是染色體中的組蛋白；
④在提取制備模板時(shí)丟失過多，或吸入酚；
⑤模板核酸變性不 底。在酶和引物質(zhì)量好時(shí)，不出現(xiàn)擴(kuò)增帶，極有可能是標(biāo)本
的消化處理，模板核酸提取過程出了毛病，因而要配制有效而穩(wěn)定的消化處理液，
其程序亦應(yīng)固定不宜隨意更改。
（2）引物的質(zhì)量與特異性
引物質(zhì)量、引物的濃度、兩條引物的濃度是否對稱，是PCR失敗或擴(kuò)增條
帶不理想、容易彌散的常見原因。有些批號的引物合成質(zhì)量有問題，兩條引物一
條濃度高，一條濃度低，造成低效率的不對稱擴(kuò)增，對策為：
①選定一個(gè)好的引物合成單位。
②引物的濃度不僅要看OD值，更要注重引物原液做瓊脂糖凝膠電泳，一定要有
引物條帶出現(xiàn)，而且兩引物帶的亮度應(yīng)大體一致，如一條引物有條帶，一條引物
無條帶，此時(shí)做PCR有可能失敗，應(yīng)和引物合成單位協(xié)商解決。如一條引物亮度
高，一條亮度低，在稀釋引物時(shí)要平衡其濃度。
③引物應(yīng)高濃度小量分裝保存，防止多次凍融或長期放冰箱冷藏部分，導(dǎo)致引物
變質(zhì)降解失效。
④引物設(shè)計(jì)不合理，如引物長度不夠，引物之間形成二聚體等。
（3）酶的質(zhì)量
酶失活：需更換新酶，或新舊兩種酶同時(shí)使用，以分析是否因酶的活性喪失或不夠而導(dǎo)致假陰性。需注意的是有時(shí)忘加Taq酶或溴乙錠。
（4）Mg2+濃度
Mg2+離子濃度對PCR擴(kuò)增效率影響很大，濃度過高可降低PCR擴(kuò)增的特異
性，濃度過低則影響PCR擴(kuò)增產(chǎn)量甚至使PCR擴(kuò)增失敗而不出擴(kuò)增條帶。
（5）反應(yīng)體積的改變
通常進(jìn)行PCR擴(kuò)增采用的體積為20ul、30ul、50ul或100ul，應(yīng)用多大體積
進(jìn)行PCR擴(kuò)增，是根據(jù)科研和臨床檢測不同目的而設(shè)定，在做小體積如20ul 后，
再做大體積時(shí)，一定要模索條件，否則容易失敗。
（6）物理原因
變性對PCR擴(kuò)增來說相當(dāng)重要，如變性溫度低，變性時(shí)間短，極有可能出現(xiàn)
假陰性；退火溫度過低，可致非特異性擴(kuò)增而降低特異性擴(kuò)增效率退火溫度過高
影響引物與模板的結(jié)合而降低PCR擴(kuò)增效率。有時(shí)還有必要用標(biāo)準(zhǔn)的溫度計(jì)，檢
測一下擴(kuò)增儀或水溶鍋內(nèi)的變性、退火和延伸溫度，這也是PCR失敗的原因之一。
（7）靶序列變異
如靶序列發(fā)生突變或缺失，影響引物與模板特異性結(jié)合，或因靶序列某段缺
失使引物與模板失去互補(bǔ)序列，其PCR擴(kuò)增是不會成功的。
5.2 假陽性
出現(xiàn)的PCR擴(kuò)增條帶與目的靶序列條帶一致，有時(shí)其條帶更整齊，亮度更高。
（1）引物設(shè)計(jì)不合適
選擇的擴(kuò)增序列與非目的擴(kuò)增序列有同源性，因而在進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)，
擴(kuò)增出的PCR產(chǎn)物為非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出現(xiàn)假
陽性。需重新設(shè)計(jì)引物。
（2）靶序列或擴(kuò)增產(chǎn)物的交叉污染
這種污染有兩種原因：一是整個(gè)基因組或大片段的交叉污染，導(dǎo)致假陽性。
這種假陽性可用以下方法解決：操作時(shí)應(yīng)小心輕柔，防止將靶序列吸入加樣槍
內(nèi)或?yàn)R出離心管外。除酶及不能耐高溫的物質(zhì)外，所有試劑或器材均應(yīng)高壓消
毒。所用離心管及樣進(jìn)槍頭等均應(yīng)一次性使用。必要時(shí)，在加標(biāo)本前，反應(yīng)管
和試劑用紫外線照射，以破壞存在的核酸。二是空氣中的小片段核酸污染，這
些小片段比靶序列短，但有一定的同源性?？苫ハ嗥唇樱c引物互補(bǔ)后，可擴(kuò)
增出PCR產(chǎn)物，而導(dǎo)致假陽性的產(chǎn)生，可用巢式PCR方法來減輕或消除。
非特異性條帶的出現(xiàn)，其原因：一是引物與靶序列不完 互補(bǔ)、 或引物聚合形成二聚體。二是Mg2+離子濃度過高、退火溫度過低，及PCR循環(huán)次數(shù)過多有關(guān)。其次是酶的質(zhì)和量，往往一些來源的酶易出現(xiàn)非特異條帶而另一來源的酶則不出現(xiàn)，酶量過多有時(shí)也會出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增。對策有：
①必要時(shí)重新設(shè)計(jì)引物；
②減低酶量或調(diào)換另一來源的酶；
③降低引物量，適當(dāng)增加模板量，減少循環(huán)次數(shù)；
④適當(dāng)提高退火溫度或采用二溫度點(diǎn)法(93℃變性，65℃左右退火與延伸)。
5.4出現(xiàn)片狀拖帶或涂抹帶
PCR擴(kuò)增有時(shí)出現(xiàn)涂抹帶或片狀帶或地毯樣帶。其原因往往由于酶量過多或酶的質(zhì)量差，dNTP濃度過高，Mg2+濃度過高，退火溫度過低，循環(huán)次數(shù)過多引起。對策為：
①減少酶量，或調(diào)換另一來源的酶。
②減少dNTP的濃度。適當(dāng)降低Mg2+濃度。增加模板量，減少循環(huán)次數(shù)。