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原位PCR分類
原位 PCR 技術(shù)(In situ PCR，Is PCR )是 Hasse 等人于 1990 年建立的技術(shù)，即在組織細 胞里進行 PCR 反應(yīng)，當時稱為“細胞內(nèi) PCR"(in cell PCR)。它結(jié)合了具有細胞定位能力的 原位雜交技術(shù)和高度特異敏感性的 PCR 技術(shù)的優(yōu)點，能檢測出細胞內(nèi)單拷貝及低拷貝的靶 DNA 或 RNA。
該方法就是利用完整的細胞作為一個微小的反應(yīng)體系來擴增細胞內(nèi)的目的片 段，在不破壞細胞的前提下，利用一些特定的檢測手段來檢測細胞內(nèi)的擴增產(chǎn)物。與原位雜 交相比，原位 PCR 技術(shù)大大提高了檢測的靈敏度。原位技術(shù)既可以分辯鑒定帶有靶序列的 細胞，又可以標出靶序列在細胞內(nèi)的位置，對有效檢測各種病原菌和從分子及細胞水平上研 究疾病的發(fā)病機理和臨床轉(zhuǎn)歸過程具有重大的實用價值。
原位 PCR 技術(shù)作為一種病原體的檢測方法，其標記物的類型可分為兩種:非放射性標 記法和放射性標記法。非放射性標記法包括如、生物素、過氧化物酶等，后者放射性 標記法多采用放射性同位素 H3h 和 P32 等。
根據(jù)標記物摻入方法的不同，原位 PCR 方法分為兩大類:即在反應(yīng)體系中使用標記的 單核苷酸或引物的直接法原位 PCR(direct in situ PCR);所用引物和單核苷酸都不帶任何標記 物，待反應(yīng)結(jié)束后再用原位雜交技術(shù)檢測特異性擴增片段產(chǎn)物的間接法原位 PCR(indirect in situ PCR)。現(xiàn)在臨床上使用最多的是間接法原位 PCR，相對于直接法原位 PCR，它的特異 性更高。
另外還有一種叫做原位反轉(zhuǎn)錄 PCR 的原位擴增方法是指在進行 PCR 之前首*行 反轉(zhuǎn)錄過程(RT)，將反轉(zhuǎn)錄的產(chǎn)物作為模板用于擴增，這個過程叫做原位反轉(zhuǎn)錄 PCR(In situ reverse transcription PCR，簡稱原位 RT-PCR)。近年出現(xiàn)的原位環(huán)式等溫擴增，即在 Is PCR 原理基礎(chǔ)上進行了改進，穿透處理條件溫和，細胞不易破碎，設(shè)計的環(huán)狀引物使擴增產(chǎn) 物分子量大，不易擴散，擴增溫度低且恒定，不使用 PCR 儀，細胞損失率大大降低。