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熒光定量PCR儀工作原理介紹
閱讀：4995 發(fā)布時(shí)間：2021-3-28
熒光定量PCR儀
1 系統(tǒng)的組成和工作原理
本系統(tǒng)由基本PCR部分、熒光檢測(cè)部分和上位計(jì)算機(jī)部分等組成。
基本PCR部分是該儀器的基礎(chǔ)，包括加熱絲、溫度采集與處理等部分，它必須具有精控溫、快速升降溫、溫度場(chǎng)均一等PCR儀的基本要求，保證PCR過(guò)程的順利完成。
熒光檢測(cè)部分包括激勵(lì)光源、光電倍增管、信號(hào)采集與處理等部分。
上位計(jì)算機(jī)部分包括數(shù)據(jù)采集和系統(tǒng)分析軟件，主要負(fù)責(zé)從下位機(jī)采集數(shù)據(jù)，形成實(shí)時(shí)圖形，并進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和圖形分析，得到目標(biāo)DNA段的含量和其它檢測(cè)報(bào)告信息等。
工作時(shí)，主計(jì)算機(jī)首先投入運(yùn)行，同時(shí)工作人員把所測(cè)樣品放入PCR反映腔體的樣品架上，工作人員根據(jù)所測(cè)樣品的PCR反應(yīng)條件設(shè)置相應(yīng)的溫度參數(shù)、控溫時(shí)間以及循環(huán)次數(shù)等，接著工作人員點(diǎn)擊相應(yīng)的按鈕控件，系統(tǒng)就進(jìn)入快速升溫、恒溫、快速降溫、恒溫等PCR循環(huán)過(guò)程，直至所有的循環(huán)結(jié)柬，同時(shí)在每一循環(huán)的低溫段恒溫結(jié)柬前系統(tǒng)進(jìn)行樣品的熒光信號(hào)實(shí)時(shí)采集，主計(jì)算機(jī)根據(jù)采集到的信號(hào)形成實(shí)時(shí)圖形，并進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和圖形分析，得到目標(biāo)DNA段的含量和其它檢測(cè)報(bào)告信息等。
2 系統(tǒng)的硬件設(shè)計(jì)
系統(tǒng)的硬件主要由溫度信號(hào)采集處理部分、熒光信號(hào)采集處理部分、單片微機(jī)控制系統(tǒng)部分、驅(qū)動(dòng)電路部分以及計(jì)算機(jī)系統(tǒng)等組成。
本系統(tǒng)由基本PCR部分、熒光檢測(cè)部分和上位計(jì)算機(jī)部分等組成。
基本PCR部分是該儀器的基礎(chǔ)，包括加熱絲、溫度采集與處理等部分，它必須具有精控溫、快速升降溫、溫度場(chǎng)均一等PCR儀的基本要求，保證PCR過(guò)程的順利完成。
熒光檢測(cè)部分包括激勵(lì)光源、光電倍增管、信號(hào)采集與處理等部分。
上位計(jì)算機(jī)部分包括數(shù)據(jù)采集和系統(tǒng)分析軟件，主要負(fù)責(zé)從下位機(jī)采集數(shù)據(jù)，形成實(shí)時(shí)圖形，并進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和圖形分析，得到目標(biāo)DNA段的含量和其它檢測(cè)報(bào)告信息等。
工作時(shí)，主計(jì)算機(jī)首先投入運(yùn)行，同時(shí)工作人員把所測(cè)樣品放入PCR反映腔體的樣品架上，工作人員根據(jù)所測(cè)樣品的PCR反應(yīng)條件設(shè)置相應(yīng)的溫度參數(shù)、控溫時(shí)間以及循環(huán)次數(shù)等，接著工作人員點(diǎn)擊相應(yīng)的按鈕控件，系統(tǒng)就進(jìn)入快速升溫、恒溫、快速降溫、恒溫等PCR循環(huán)過(guò)程，直至所有的循環(huán)結(jié)柬，同時(shí)在每一循環(huán)的低溫段恒溫結(jié)柬前系統(tǒng)進(jìn)行樣品的熒光信號(hào)實(shí)時(shí)采集，主計(jì)算機(jī)根據(jù)采集到的信號(hào)形成實(shí)時(shí)圖形，并進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和圖形分析，得到目標(biāo)DNA段的含量和其它檢測(cè)報(bào)告信息等。
2 系統(tǒng)的硬件設(shè)計(jì)
系統(tǒng)的硬件主要由溫度信號(hào)采集處理部分、熒光信號(hào)采集處理部分、單片微機(jī)控制系統(tǒng)部分、驅(qū)動(dòng)電路部分以及計(jì)算機(jī)系統(tǒng)等組成。
2．1 溫度信號(hào)采集處理部分
這一部分包括溫度傳感器、傳感器接口電路以及信號(hào)放大電路，在這里溫度傳感器采用熱電偶，由于熱電偶通過(guò)微小電壓進(jìn)行溫度測(cè)量，容易受干擾，在具體的設(shè)計(jì)中，干擾問(wèn)題往往很難一下拿出明確的解決方案，要根據(jù)干擾的種類找原因，對(duì)癥下藥。在本設(shè)計(jì)中，主要采取了以下的抗干擾措施，保證溫度采集的準(zhǔn)確性：（1）在熱電偶的輸出端追加濾波電容；（2）加變送器，利用熱電偶的接口芯片，把溫度信號(hào)直接轉(zhuǎn)換成電壓信號(hào)，這個(gè)信號(hào)不易受干擾。
2．2 熒光信號(hào)采集處理部分
熒光信號(hào)采集處理部分主要包括光檢測(cè)系統(tǒng)和信號(hào)采樣處理系統(tǒng)兩部分。
2．2．1 光檢測(cè)系統(tǒng)
光檢測(cè)系統(tǒng)主要包括光源（待測(cè)樣品）、濾光片、光電倍增管以及敏感度選擇電路等。微處理器在檢測(cè)過(guò)程中，按光檢測(cè)值大小動(dòng)態(tài)調(diào)整電位器輸出，改變光電倍增管控制電壓板的電壓輸入，自動(dòng)調(diào)整光電倍增管測(cè)量靈敏度。
光電倍增管采用H5783型倍增管，它具有如下特性：
（1）結(jié)構(gòu)上將倍增管、電磁屏蔽筒、高低壓供電單元、電壓控制單元全部集成在一起，使用方便；（2）光譜靈敏度高，暗電流小；（3）可根據(jù)測(cè)量光信號(hào)強(qiáng)度的不同，通過(guò)程序調(diào)節(jié)控制電壓，自動(dòng)調(diào)整測(cè)量系統(tǒng)的靈敏度。
這一部分包括溫度傳感器、傳感器接口電路以及信號(hào)放大電路，在這里溫度傳感器采用熱電偶，由于熱電偶通過(guò)微小電壓進(jìn)行溫度測(cè)量，容易受干擾，在具體的設(shè)計(jì)中，干擾問(wèn)題往往很難一下拿出明確的解決方案，要根據(jù)干擾的種類找原因，對(duì)癥下藥。在本設(shè)計(jì)中，主要采取了以下的抗干擾措施，保證溫度采集的準(zhǔn)確性：（1）在熱電偶的輸出端追加濾波電容；（2）加變送器，利用熱電偶的接口芯片，把溫度信號(hào)直接轉(zhuǎn)換成電壓信號(hào)，這個(gè)信號(hào)不易受干擾。
2．2 熒光信號(hào)采集處理部分
熒光信號(hào)采集處理部分主要包括光檢測(cè)系統(tǒng)和信號(hào)采樣處理系統(tǒng)兩部分。
2．2．1 光檢測(cè)系統(tǒng)
光檢測(cè)系統(tǒng)主要包括光源（待測(cè)樣品）、濾光片、光電倍增管以及敏感度選擇電路等。微處理器在檢測(cè)過(guò)程中，按光檢測(cè)值大小動(dòng)態(tài)調(diào)整電位器輸出，改變光電倍增管控制電壓板的電壓輸入，自動(dòng)調(diào)整光電倍增管測(cè)量靈敏度。
光電倍增管采用H5783型倍增管，它具有如下特性：
（1）結(jié)構(gòu)上將倍增管、電磁屏蔽筒、高低壓供電單元、電壓控制單元全部集成在一起，使用方便；（2）光譜靈敏度高，暗電流小；（3）可根據(jù)測(cè)量光信號(hào)強(qiáng)度的不同，通過(guò)程序調(diào)節(jié)控制電壓，自動(dòng)調(diào)整測(cè)量系統(tǒng)的靈敏度。
2．2．2 信號(hào)采樣處理電路
光電倍增管輸出的電流信號(hào)可作為恒流源，將運(yùn)算放大器作為負(fù)載電阻實(shí)現(xiàn)電流電壓的轉(zhuǎn)換， 信號(hào)處理電路,其輸出電壓U0=一gf~xf，式中g(shù)f為運(yùn)算放大器的反饋電阻，反饋電阻Rf值的選擇要按光電倍增管陽(yáng)極的最大輸出電流、A／D采樣輸入滿量程值、運(yùn)算放大器的開環(huán)增益等來(lái)確定，同時(shí)還要考慮保證系統(tǒng)的高頻特性。
輸出電路的最小可測(cè)量電流受到運(yùn)算放大器的偏置電流、溫飄、反饋電阻特性以及電路板的絕緣性能的影響。
2．3 單片微機(jī)控制系統(tǒng)
這一部分主要負(fù)責(zé)溫度的采集、溫度的控制、熒光信號(hào)的采集以及對(duì)光電倍增管控制極電壓的調(diào)整、外圍執(zhí)行機(jī)構(gòu)的驅(qū)動(dòng)控制以及與上位計(jì)算機(jī)的實(shí)時(shí)通訊等。主要由微處理器、A／D轉(zhuǎn)換芯片、通信接口芯片等組成。在該系統(tǒng)中，微處理器采用P89C51微處理器。該芯片具有并行可編程的非易失性FLASH程序存儲(chǔ)器。是80C51的派生器件，指令系統(tǒng)與80C51*相同，其主要特性為：
（1）速度可達(dá)32M；（2）片內(nèi)FLASH程序存儲(chǔ)器，可在線編程；（3）RAM 可擴(kuò)展到65K字節(jié)；（4）全雙工增強(qiáng)型UART~（5）4個(gè)8位I/O 口；（6）6個(gè)中斷源。上述特性可實(shí)現(xiàn)本系統(tǒng)所要求的實(shí)時(shí)檢測(cè)處理、控制、通訊等功能。
A/D轉(zhuǎn)換芯片采用AD674，該芯片是美國(guó)模擬器件公司（Analog Devices）生產(chǎn)的12位逐次逼近快速A/D轉(zhuǎn)換器。
片內(nèi)配有三態(tài)輸出緩沖電路，可直接與各種典型的8位或16位微處理器相連，而無(wú)須附加邏輯接口電路，且能與CMOS及1vrL電平兼容，并且片內(nèi)含有高精度的參考電壓源和時(shí)鐘電路，這使它在不需要任何外部電路和時(shí)鐘信號(hào)的情況下完成一切A/D轉(zhuǎn)換功能，應(yīng)用非常方便。為了保證A/D采樣的準(zhǔn)確性模擬信號(hào)輸入端可加采保器LF398。要注意的一點(diǎn)是與P89C51單片機(jī)接口電路設(shè)計(jì)時(shí)。單片機(jī)的時(shí)鐘一定要接12M及以上，防止因AD674數(shù)據(jù)總線傳輸速度快而造成時(shí)序不匹配。
光電倍增管輸出的電流信號(hào)可作為恒流源，將運(yùn)算放大器作為負(fù)載電阻實(shí)現(xiàn)電流電壓的轉(zhuǎn)換， 信號(hào)處理電路,其輸出電壓U0=一gf~xf，式中g(shù)f為運(yùn)算放大器的反饋電阻，反饋電阻Rf值的選擇要按光電倍增管陽(yáng)極的最大輸出電流、A／D采樣輸入滿量程值、運(yùn)算放大器的開環(huán)增益等來(lái)確定，同時(shí)還要考慮保證系統(tǒng)的高頻特性。
輸出電路的最小可測(cè)量電流受到運(yùn)算放大器的偏置電流、溫飄、反饋電阻特性以及電路板的絕緣性能的影響。
2．3 單片微機(jī)控制系統(tǒng)
這一部分主要負(fù)責(zé)溫度的采集、溫度的控制、熒光信號(hào)的采集以及對(duì)光電倍增管控制極電壓的調(diào)整、外圍執(zhí)行機(jī)構(gòu)的驅(qū)動(dòng)控制以及與上位計(jì)算機(jī)的實(shí)時(shí)通訊等。主要由微處理器、A／D轉(zhuǎn)換芯片、通信接口芯片等組成。在該系統(tǒng)中，微處理器采用P89C51微處理器。該芯片具有并行可編程的非易失性FLASH程序存儲(chǔ)器。是80C51的派生器件，指令系統(tǒng)與80C51*相同，其主要特性為：
（1）速度可達(dá)32M；（2）片內(nèi)FLASH程序存儲(chǔ)器，可在線編程；（3）RAM 可擴(kuò)展到65K字節(jié)；（4）全雙工增強(qiáng)型UART~（5）4個(gè)8位I/O 口；（6）6個(gè)中斷源。上述特性可實(shí)現(xiàn)本系統(tǒng)所要求的實(shí)時(shí)檢測(cè)處理、控制、通訊等功能。
A/D轉(zhuǎn)換芯片采用AD674，該芯片是美國(guó)模擬器件公司（Analog Devices）生產(chǎn)的12位逐次逼近快速A/D轉(zhuǎn)換器。
片內(nèi)配有三態(tài)輸出緩沖電路，可直接與各種典型的8位或16位微處理器相連，而無(wú)須附加邏輯接口電路，且能與CMOS及1vrL電平兼容，并且片內(nèi)含有高精度的參考電壓源和時(shí)鐘電路，這使它在不需要任何外部電路和時(shí)鐘信號(hào)的情況下完成一切A/D轉(zhuǎn)換功能，應(yīng)用非常方便。為了保證A/D采樣的準(zhǔn)確性模擬信號(hào)輸入端可加采保器LF398。要注意的一點(diǎn)是與P89C51單片機(jī)接口電路設(shè)計(jì)時(shí)。單片機(jī)的時(shí)鐘一定要接12M及以上，防止因AD674數(shù)據(jù)總線傳輸速度快而造成時(shí)序不匹配。
2．4 驅(qū)動(dòng)電路部分
考慮到風(fēng)門電機(jī)、磁吸開關(guān)、轉(zhuǎn)盤電機(jī)、加熱風(fēng)扇等外圍執(zhí)行設(shè)施較多，而且要分別單獨(dú)供電，同時(shí)，為了克服上述外設(shè)對(duì)微計(jì)算機(jī)系統(tǒng)可能造成的干擾，就把這一部分單獨(dú)做成一塊驅(qū)動(dòng)板，由單片機(jī)系統(tǒng)I／O擴(kuò)展口直接驅(qū)動(dòng)光電耦合器件，經(jīng)光電耦合器件的輸出端再加電流放大驅(qū)動(dòng)。
考慮到風(fēng)門電機(jī)、磁吸開關(guān)、轉(zhuǎn)盤電機(jī)、加熱風(fēng)扇等外圍執(zhí)行設(shè)施較多，而且要分別單獨(dú)供電，同時(shí)，為了克服上述外設(shè)對(duì)微計(jì)算機(jī)系統(tǒng)可能造成的干擾，就把這一部分單獨(dú)做成一塊驅(qū)動(dòng)板，由單片機(jī)系統(tǒng)I／O擴(kuò)展口直接驅(qū)動(dòng)光電耦合器件，經(jīng)光電耦合器件的輸出端再加電流放大驅(qū)動(dòng)。