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PCR擴增效率的評估-擴增曲線的解讀
做過PCR的小伙伴都知道，PCR前期的驗證引物探針性能和確定最適反應(yīng)條件是確保正式實驗順利進行的前提。PCR實驗中有個相當(dāng)重要的工作——即是PCR擴增效率的評估。擴增效率是PCR檢測性能最重要的指標(biāo)之一，也是定量分析計算結(jié)果時所需要的參數(shù)。接下來，讓小編給大家細(xì)細(xì)說來吧。
什么是擴增效率
PCR是一種DNA體外擴增技術(shù)，通常包括了30 - 50個循環(huán)周期。每個循環(huán)中，目標(biāo)DNA分子的拷貝數(shù)最多會增加1倍。但在實際反應(yīng)中，1個DNA分子在1個擴增循環(huán)后被成功復(fù)制的概率，也就是擴增效率E<1。而PCR的特點是反應(yīng)初期目標(biāo)DNA分子呈現(xiàn)指數(shù)增長，這個階段的擴增效率可以無限接近于1；隨后由于反應(yīng)組分消耗或聚合酶活性下降或兩者共同作用，導(dǎo)致反應(yīng)效率逐漸下降并最終停止。不管是定量DNA分子初始量，還是計算表達(dá)量差異，都需要精評估PCR擴增效率。
如何評估擴增效率
標(biāo)準(zhǔn)曲線是評估PCR擴增效率可靠和穩(wěn)定的一種方法，被研究者們廣泛認(rèn)可。該方法涉及到制作一系列的樣品來控制目標(biāo)模板的相對數(shù)量。這些樣品通常由濃縮的原液連續(xù)稀釋而成，常用的是10倍稀釋。使用一系列稀釋樣品，采用標(biāo)準(zhǔn)qPCR程序進行擴增獲得Cq值，最后根據(jù)各樣品濃度及相應(yīng)的Cq值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到線性方程Cq= -klgX0+b，擴增效率E=10(-1/k)-1。利用qPCR進行定量分析時，要求擴增效率范圍在90%-110%（3.6＞k＞3.1）。
影響擴增效率的關(guān)鍵因素
PCR的效率取決于許多因素，包括以下方面：
1）檢測的性能。這取決于引物、模板的序列和結(jié)構(gòu)。二級結(jié)構(gòu)和分子間的相互作用都會降低PCR效率。
2）樣品基質(zhì)。其中可能含有來自樣品的抑制劑和其他干擾物質(zhì)，或攜帶來自上游加工步驟的試劑。檢測樣品是否有抑制作用，可使用RNA或DNA Spikes方法進行檢測，或者通過倍比稀釋得到標(biāo)準(zhǔn)曲線也可以觀察到。
3）所用試劑及其濃度。本質(zhì)上，任何PCR試劑都會一定程度上限制PCR反應(yīng)速率和性能。
4）競爭性反應(yīng)。多重反應(yīng)時，各基因的擴增存在反應(yīng)成分的競爭。
5）qPCR儀器。由于儀器特定的硬件/軟件屬性和設(shè)置、以及用于提取Cq值的特定算法不同，相同的實驗中，不同的儀器會產(chǎn)生不同的PCR效率。
6）技術(shù)重復(fù)。一般進行3次以上的技術(shù)重復(fù)以校正實驗誤差，重復(fù)數(shù)越多精度越高。
7）連續(xù)稀釋中的移液體積。移液體積越大，移液器誤差或操作誤差引起的影響越小。
qPCR擴增效率的判斷
qPCR擴增效率主要是通過標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性關(guān)系方程Cq=-klgX0+b來判斷，擴增效率E在90%-110%之間時，認(rèn)為擴增接近理想情況；參數(shù)R2要求≥0.98，R2越接近1，則說明Cq和X0的Log值之間的相關(guān)性越高。
那么擴增效率E表現(xiàn)不好，主要分為兩種情況：
1）過低的擴增效率（<90％）
可能存在的原因：
? 移液器校準(zhǔn)不良或移液技術(shù)差。
? 不正確的稀釋導(dǎo)致標(biāo)準(zhǔn)曲線出現(xiàn)錯誤。
? 染料濃度低熒光或者儀器未校準(zhǔn)染料。
? 引物設(shè)計不好或擴增子具有二級結(jié)構(gòu)。
? 標(biāo)準(zhǔn)曲線動態(tài)范圍太小。
? Taq酶無活性或活性降低。
? 樣品抑制。
2）過高的擴增效率（> 110％）
可能存在的原因：
? 移液器校準(zhǔn)不良或移液技術(shù)差。
? 不正確的稀釋導(dǎo)致標(biāo)準(zhǔn)曲線出現(xiàn)錯誤。
? 引物二聚體或非特異性擴增。
? 標(biāo)準(zhǔn)曲線動態(tài)范圍太小。
? 基因組DNA污染（僅限RNA模板未進行DNase I處理或DNase I消化不*）。