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組織樣本裂解細(xì)胞的方法
閱讀：1239 發(fā)布時(shí)間：2015-8-20在試驗(yàn)中，不同的細(xì)胞采用不同的裂解方法。如研磨，細(xì)胞勻漿，TritonX--100，稀減法等等。那么，具體該怎樣選擇細(xì)胞的裂解方法？本節(jié)內(nèi)容主要圍繞組織樣本裂解細(xì)胞的方法做詳細(xì)介紹。具體操作方法流程如下，也歡迎廣大新老客戶提供寶貴建議參與我司探討交流。
1. 把組織剪切成細(xì)小的碎片。
2. 融解RIPA裂解液，混勻。取適當(dāng)量的裂解液，在使用前數(shù)分鐘內(nèi)加入PMSF，使PMSF的zui終濃度為1mM。
3. 按照每20毫克組織加入150-250微升裂解液的比例加入裂解液。(如果裂解不充分可以適當(dāng)添加更多的裂解液，如果需要高濃度的蛋白樣品，可以適當(dāng)減少裂解液的用量。)
4. 用玻璃勻漿器勻漿，直至充分裂解。
5. 充分裂解后，10000-14000g離心3-5分鐘，取上清，即可進(jìn)行后續(xù)的PAGE、Western和免疫沉淀等操作。
6. 如果組織樣品本身非常細(xì)小，可以適當(dāng)剪切后直接加入裂解液裂解，通過(guò)強(qiáng)烈vortex使樣品裂解充分。然后同樣離心取上清，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。直接裂解的優(yōu)點(diǎn)是比較方便，不必使用勻漿器，缺點(diǎn)是不如使用勻漿器那樣裂解得比較充分。
注：RIPA裂解液的裂解產(chǎn)物中經(jīng)常會(huì)出現(xiàn)一小團(tuán)透明膠狀物，屬正常現(xiàn)象。該透明膠狀物為含有基因組DNA等的復(fù)合物。在不檢測(cè)和基因組DNA結(jié)合特別緊密的蛋白的情況下，可以直接離心取上清用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)；如果需要檢測(cè)和基因組結(jié)合特別緊密的蛋白，則可以通過(guò)超聲處理打碎打散該透明膠狀物，隨后離心取上清用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。如果檢測(cè)一些常見(jiàn)的轉(zhuǎn)錄因子，例如NF-kappaB、p53等時(shí)，通常不必進(jìn)行超聲處理，就可以檢測(cè)到這些轉(zhuǎn)錄因子。