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 原因

解决方法

一抗与膜的孵育时间不够

磷酸化蛋白抗体是针对于特定的一个或两个磷酸化位点的，特异性很高但往往比常规的抗体能得到的信号要弱一些。用合适的缓冲液稀释，并在4°C与膜孵育过一夜，对于磷酸化抗体来说很关键。

电泳后的蛋白没有全部转移到膜上

增加转膜所用的时间或电压。通过预染分子量标准品判断转膜是否*，不建议用染料染膜来观察，因为这样会抑制化学发光反应。

膜的封闭时间过长

在牛奶中封闭时间太长会遮蔽抗原表位并会把转移到膜上的蛋白置换下来。封闭只需1小时（决不要过一夜封闭）。

目的基因的表达量太少，低于检测底限。

每条泳道中上样总蛋白20 μg通常就足够了。如果目的基因的表达水平较低，则可以增加上样量?；蚴窃谧鯯DS-PAGE之前先做免疫沉淀。尝试其他细胞系或是高表达该蛋白的组织样品。

二抗太弱。

换用其他批次的二抗或是提高二抗的浓度。

LumiGLO^?试剂没有按规定配制或是储存液试剂A和B已经相互污染。

重新配制LumiGLO^?试剂。用抗生物素-HRP和生物素标记的分子量标准品作为化学发光检测反应的阳性对照。