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免疫組化知識(shí)大全,趕緊get起來!

閱讀:1034          發(fā)布時(shí)間:2017-1-5

   免疫組化,是應(yīng)用免疫學(xué)基本原理——抗原抗體反應(yīng),即抗原與抗體特異性結(jié)合的原理,通過化學(xué)反應(yīng)使標(biāo)記抗體的顯色劑(熒光素、酶、金屬離子、同位素)顯色來確定組織細(xì)胞內(nèi)抗原(多肽和蛋白質(zhì)),對(duì)其進(jìn)行定位、定性及相對(duì)定量的研究,稱為免疫組織化學(xué)技術(shù)(immunohistochemistry)或免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)(immunocytochemistry)。


實(shí)驗(yàn)所用的標(biāo)本:
   實(shí)驗(yàn)所用主要為組織標(biāo)本和細(xì)胞標(biāo)本兩大類,前者包括石蠟切片(病理切片和組織芯片)和冰凍切片,后者包括組織印片、細(xì)胞爬片和細(xì)胞涂片。


   其中石蠟切片是制作組織標(biāo)本zui常用、zui基本的方法,對(duì)于組織形態(tài)保存好,且能作連續(xù)切片,有利于各種染色對(duì)照觀察;還能長(zhǎng)期存檔,供回顧性研究;石蠟切片制作過程對(duì)組織內(nèi)抗原暴露有一定的影響,但可進(jìn)行抗原修復(fù),是免疫組化中的組織標(biāo)本制作方法。


實(shí)驗(yàn)所用的抗體:
   免疫組化實(shí)驗(yàn)中常用的抗體為單克隆抗體和多克隆抗體,單克隆抗體是一個(gè)B淋巴細(xì)胞克隆分泌的抗體,應(yīng)用細(xì)胞融合雜交瘤技術(shù)免疫動(dòng)物制備。多克隆抗體是將純化后的抗原直接免疫動(dòng)物后,從動(dòng)物血中所獲得的免疫血清,是多個(gè)B淋巴細(xì)胞克隆所產(chǎn)生的抗體混合物。


常用的染色方法:
   根據(jù)標(biāo)記物的不同分為免疫熒光法,免疫酶標(biāo)法,親和組織化學(xué)法,后者是以一種物質(zhì)對(duì)某種組織成分具有高度親合力為基礎(chǔ)的檢測(cè)方法。這種方法敏感性更高,有利于微量抗原(抗體)在細(xì)胞或亞細(xì)胞水平的定位,其中生物素—抗生物素染色法zui常用。

 

免疫組化實(shí)驗(yàn)步驟:
1.  石蠟切片置于67℃烘箱中,烘片2小時(shí),脫蠟至水,用pH7.4的PBS沖洗三次,每次3分鐘(3×3’)。
2.  取一定量pH=6.0檸檬酸鹽緩沖液,加入微波盒中,微波加熱至沸騰,將脫蠟水化后的組織切片置于耐高溫塑料切片架上,放入已沸騰的緩沖液中,中檔微波處理10分鐘,取出微波盒流水自然泠卻,從緩沖液中取出玻片,先用蒸餾水沖洗兩次,之后用PBS沖洗2×3’。(注:不是所有的抗體都需要微波修復(fù)的,視具體情況而定)
3.  每張切片加1滴3%H2O2,室溫下孵育10分鐘,以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶的活性。PBS沖洗3×3’。


免疫組化特點(diǎn):
1.  在切片加上一抗后,第二抗體標(biāo)記多聚螯合物酶(HRP)的復(fù)合物與一抗結(jié)合,在多聚螯合物上有大量的HRP分子,使抗原信號(hào)有顯著的放大,其敏感性較SABC、SP法高。
2.  由于多聚物在體內(nèi)不存在,又不使用生物素,從而避免了由于生物素引起的非特異性背景染色,背景比SABC、SP法清晰。

 

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