小鼠胆碱乙酰转移酶（ChAT）酶联免疫试剂盒用于体外定量检测血清、血浆、组织、细胞上清及相关液体样本中小鼠胆碱乙酰转移酶（ChAT）的含量。

小鼠胆碱乙酰转移酶（ChAT）酶联免疫试剂盒

l 本试剂盒用于体外定量检测血清、血浆、组织、细胞上清及相关液体样本中小鼠胆碱乙酰转移酶（ChAT）的含量。

l 有效期：6个月

l 保存条件：2-8℃

l 本试剂盒仅供体外研究使用，不用于临床诊断

 

实验原理

试剂盒采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验（ELISA）。往预先包被小鼠胆碱乙酰转移酶（ChAT）捕获抗体的包被微孔中，依次加入标本、标准品、HRP标记的检测抗体，经过温育并*洗涤。用底物TMB显色，TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成zui终的黄色。颜色的深浅和样品中的小鼠胆碱乙酰转移酶（ChAT）呈正相关。用酶标仪在450nm 波长下测定吸光度（OD 值），计算样品浓度。

小鼠胆碱乙酰转移酶（ChAT）酶联免疫试剂盒准备试剂与收集血样

1.          收集标本：血清、血浆（EDTA）、细胞培养上清液、组织匀浆等裂解产物尽早检测，2-8℃保存48小时；更长时间须冷冻（-20 ℃或-70 ℃）保存，避免反复冻融。

2.          标准品液配制：使用前加入0.5ml蒸馏水混匀，配成16000pg/ml的溶液。设标准管8管，每管加入标本稀释液200ul。在*管中加入16000pg/ml的标准品溶液200ul混匀后用加样器吸出200ul，移至第二管。如此反复作对倍稀释，从第七管中吸出200ul弃去。第八管为空白对照。

3.          10×标本稀释液用蒸馏水作1:10倍稀释（示例：1ml浓稀释液+9ml蒸馏水）。

4.         洗涤液：用重蒸水1:20稀释（示例：1ml浓缩洗涤液加入19ml的重蒸水）

标本激活方法

             1.   将450ul标本稀释液加入到一支1.5ml进口聚丙烯管中,再加10ul血清或血浆标本。

 2.   加20ul 1 N HCI,盖紧，上下混匀。2－8℃放置60± 2分钟。

     3.   加20ul 1 N NaOH,盖紧，上下混匀。

     4.   即用，或放-20/-70℃保存3天。计算结果时乘以稀释倍数50。（注意：不同的标本HSP60的水平可能有较大差异，请根据实际情况灵活掌握稀释度）

     5.   细胞培养上清或组织匀浆10倍稀释(410ul的标本稀释液＋50ul样本＋20ul的1N HCI+20ul的1N NaOH)。

改良双抗体夹心法

本法是双抗体夹心法的一种改良形式，也是用于测定抗原的，其原理可用图来表示。本法首先是将特异性抗体a包被于固相载体，经洗涤加入含有欲测抗原之待检样品。经孵育洗涤后再加一次未标记的特异性抗体b，而这次加入的抗体b于*次包被于固相载体上的特异性抗体a对被测抗原来说都是特异性的，但不是用同种动物免疫制备的，否则可出现非特异性反应。经孵育洗涤后，再加酶标记抗b抗体，再经孵育洗涤后加底物显色进行测定。这种方法与双抗体夹心法不同之处是多加了一层抗体。因此，放大的倍数更高，故比双抗体夹心法更加灵敏。同时避免标记特异性抗体，而另一优点是只要标记一种抗抗体，即可达到多种应用。

检测程序

1.          加样：每孔各加入标准品或待测样品（已激活）100ul，将反应板充分混匀后置37℃120分钟。

2.          洗板：用洗涤液将反应板充分洗涤4-6次，向滤纸上印干。

3.          每孔中加入*抗体工作液100ul。将反应板充分混匀后置37℃60分钟。

4.          洗板：同前。

5.          每孔加酶标抗体工作液100ul。将反应板置37℃30分钟。

6.          洗板：同前。

7.          每孔加入底物工作液100ul，置37 ℃暗处反应15分钟。

8.          每孔加入100ul终止液混匀。

9.          30分钟内用酶标仪在450nm处测吸光值。

结果计算与判断

1.          所有OD值都应减除空白值后再行计算。

2.          以标准品8000、4000、2000、1000、500、250、125、0 pg/ml为横坐标，OD值为纵坐标，在坐标纸上作图，画出标准曲线。

3.          根据样品OD值在该曲线图上查出相应HSP60含量，再乘上稀释倍数即可。

试剂盒性能

             1.   灵敏度：zui小的HSP60 检测浓度小于65pg/ml。

2.        特异性：可同时检测重组或天然的人HSP60。不与人其它细胞因子有交叉反应。

3.        重复性：板内、板见变异系数均小于12％。

注意事项

             1.   以上标准孔及待测样品均建议做复孔，每次测定应同时做标准曲线。

 2.   洗涤过程很关键。洗涤不充分将导致精确度误差及OD值错误地升高。

             3.   板条开封后剩余板条要再封好，保持板条干燥。

             4.   本试剂盒宜置4oC冰箱保存。

 5.   本试剂盒仅用于科研，不能用于临床诊断！