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上海源葉生物科技有限公司
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IL-16的檢測(cè)
2012-5-5 閱讀(823)
即以前的淋巴細(xì)胞趨化因子（1ymphocytechemoattractantfactor，LCF）。主要由CD8+T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生，對(duì)T淋巴細(xì)胞特別是CD4+細(xì)胞具有選擇性趨化作用。
（1）IL-16的誘生
1）分離PBMC，調(diào)整細(xì)胞濃度為3X106／mL，加入平底培養(yǎng)板中，置37℃5％C02溫箱培養(yǎng)。
2）加入血清素（serotonin，即5-羥色胺），使終濃度為10—4moL／L，培養(yǎng)24h，離心收獲上清用于IL-16活性檢測(cè)。
（2）IL-16的測(cè)定：可根據(jù)IL-16對(duì)淋巴細(xì)胞的趨化作用測(cè)定其活性。
1）用尼龍棉分離法分離外周血中T淋巴細(xì)胞。
2）用RPMI-1640培養(yǎng)液將分離的T細(xì)胞或CD4+T細(xì)胞配成5X106—lO7／mL。
3）取48孔趨化板，底板各孔加入30／uL不同稀釋度的標(biāo)準(zhǔn)品或待測(cè)樣品，并設(shè)培養(yǎng)液對(duì)照孔，均做3復(fù)孔。在培養(yǎng)板之上覆以8um孔徑的硝酸纖維素膜，小心讓膜與樣品溶液接觸，不能有氣泡及不讓各孔中的液體相混。
4）蓋上頂板并固定。用0．2mL培養(yǎng)液洗滌各上孔，洗去固定時(shí)可能濾人上孔的樣品溶液。在頂板各孔中加入50／uL（約2．5X105～5X105）細(xì)胞懸液，置37~C 5％C02溫箱中孵育3h，讓細(xì)胞從膜上面向下趨化運(yùn)動(dòng)。
5）小心取下膜，洗去膜上表面的細(xì)胞，并將膜下表面（粘附著趨化的細(xì)胞）向上置玻璃板上，固定細(xì)胞，用蘇木精染色細(xì)胞。
凸）在高倍顯微鏡下計(jì)數(shù)趨化的細(xì)胞，以對(duì)照孔每視野約10個(gè)細(xì)胞的濃度，計(jì)數(shù)5個(gè)視野的全部細(xì)胞。取3個(gè)重復(fù)孔細(xì)胞的平均數(shù)。結(jié)果以％表示：
趨化％=試驗(yàn)孔細(xì)胞數(shù)／對(duì)照孔細(xì)胞數(shù)×100％
（3）注意事項(xiàng)：多種細(xì)胞因子具有趨化活性，如IL-8、IL-16、PANTES、MCP及MIP等?？捎冕槍?duì)不同細(xì)胞因子的中和抗體作中和實(shí)驗(yàn)對(duì)照以了解趨化活性的特異性。實(shí)驗(yàn)時(shí)可將適量的中和抗體與細(xì)胞因子樣品一起加入底板各孔中，37℃作用15min，然后蓋上頂板，加入細(xì)胞。如上進(jìn)行趨化試驗(yàn)，并比較中和抗體對(duì)照與試驗(yàn)孔的結(jié)果可區(qū)分不同趨化因子的作用。
