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“上海恒远”文献：β－胡萝卜素对高糖诱导的 血管内皮细胞损伤的?；ぷ饔?/h3>
阅读：482 发布时间：2019-4-3
邱模昌，蔡灵卿，王 芳，刘建明，程畅河
（江西医学高等专科学校药学系，江西 上饶３３４０００）
摘要：目的 研究β－胡萝卜素（β－Ｃ）对高糖诱导的内皮细胞损伤的?；ぷ饔?/span>，并初步探讨其作用机制。方法 在血管内皮细胞长至８０％ 以上融合时，将其分为５组：正常对照组、高糖损伤组及低、中和高剂量β－Ｃ 组，每组６ 个复孔。正常对照组加入１０％ 葡萄糖注射液５．５ ｍｍｏｌ·Ｌ－１ ，高糖损伤组加入１０％ 葡萄糖注射液３３ ｍｍｏｌ·Ｌ－１ ，低、
中和高剂量β－Ｃ 组分别加入β－Ｃ１０、２０、４０μｍｏｌ·Ｌ－１ ＋１０％ 葡萄糖注射液３３ ｍｍｏｌ·Ｌ－１ 。各组放置５％ＣＯ２ 培养箱中培养４８ｈ后，收集细胞或培养液进行实验。使用酶联免疫检测仪、采用 ＭＴＴ 比色法检测５ 组血管内皮细
胞存活率，采用流式细胞仪检测血管内皮细胞凋亡率、血管内皮细胞中活性氧（ＲＯＳ）水平，使用全自动生化仪、采用乳酸→丙酮酸连续监测法检测５组血管内皮细胞培养液中乳酸脱氢酶（ＬＤＨ）活性，使用全自动生化仪、采用硫代巴比妥酸比色定量法检测５组血管内皮细胞培养液中丙二醛（ＭＤＡ）的水平；先参照 ＮＯ 检测试剂盒的使用说明书进行实验，后采用酶联免疫检测仪检测５组血管内皮细胞培养液中 ＮＯ 水平。结果 与正常对照组比较，高糖损伤组的血管内皮细胞存活率、血管内皮细胞培养液中 ＮＯ 水平均明显降低，血管内皮细胞培养液中 ＬＤＨ 活性、
ＭＤＡ 水平，血管内皮细胞凋亡率、血管内皮细胞中 ＲＯＳ水平均明显升高（均 Ｐ＜０．０１）；与高糖损伤组比较，中、高剂量β－Ｃ 组的血管内皮细胞存活率、血管内皮细胞培养液中 ＮＯ 水平均明显升高，血管内皮细胞培养液中 ＬＤＨ 活性、ＭＤＡ 水平及低、中和高剂量β－Ｃ 组的血管内皮细胞凋亡率、血管内皮细胞中 ＲＯＳ水平均明显降低（Ｐ＜０．０５或
Ｐ＜０．０１）。结论 β－胡萝卜素对高糖诱导的脐静脉内皮细胞的损伤具有?；ぷ饔?/span>，其机制可能与增加 ＮＯ 水平和
促进 ＲＯＳ的降解有关。
关键词：糖尿病；β－胡萝卜素；高糖；血管内皮细胞损伤；活性氧；脐静脉；保护作用
中图分类号：Ｒ９６；Ｒ５８７．１ 文献标志码：Ａ 文章编号：２０９５－４７２７（２０１４）０７－００２４－０５
β－胡萝卜素（β－ｃａｒｏｔｅｎｅ，β－Ｃ）是常见类胡萝卜素之一，类胡萝卜素呈现很强的抗氧化性，具有清除
自由基、?；ぱ?/span>、抗肿瘤、护肤、增强免疫功能及保护神经系统等作用。有研究［７］发现，β－Ｃ 能充分提
高 ＮＯ 的水平和生物利用度，舒张血管，保护血管，
同时β－Ｃ 还能抑制 ＲＯＳ水平的升高，保持机体抗氧化能力和不断产生的氧自由基的氧化能力之间的动态平衡，预防动脉粥样硬化等的发生，但β－Ｃ 对高糖
诱导的血管内皮细胞损伤的?；ばвδ壳把芯拷?/span>
少。本研究观察了β－Ｃ 对血管内皮细胞损伤的?；?/span>效应，并从 ＲＯＳ与 ＮＯ 途径探讨β－Ｃ 对血管内皮细胞损伤的?；ばв?/span>。
１ 材料与方法
１．１ 实验材料
人脐静脉内皮细胞株 ＨＵＶＥＣ－１９ 购自中南大学（源自 ＡＴＣＣ 细胞库），ＤＭＥＭ 培养基（上海恒远生物科技有限公司），ＭＴＴ 溶液、Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ、
ＬＤＭＳＯ、乳 酸 脱 氢 酶 （ＬＤＨ ）试 剂 盒 和 丙 二 醛
（ＭＤＡ）试剂盒（海门市碧云天生物技术研究所），
沙长锦应用技术研究所），６５２ 酶联免疫检测仪（美国ＢＩＯ－ＲＡＤ 公司），ＤＸＣ６００全自动生化分析仪（美国 Ｂｅｃｋｍａｎ 公司），ＦＡＣＳＣ－ＡＬＩＢＵＲ 流式细胞仪
（美国ＢＤ 公司）。
１．２ 实验方法
１．２．１ 血管内皮细胞培养与实验分组、加药方法
１）将人脐静脉内皮细胞株 ＨＵＶＥＣ－１９ 传代至第３代后用２０％ＤＭＥＭ（含１０％ 胎牛血清）悬浮细胞，计数后以５×１０３／孔的细胞数接种于六孔板培养板中，待 细胞长至 ８０％ 以上融合时进行实验。
２）在血管内皮细胞长至８０％ 以上融合时，将其分为
５组：正常对照组、高糖损伤组及低、中和高剂量β－Ｃ 组，每组６个复孔。正常对照组加入１０％ 葡萄糖注射液５．５ ｍｍｏｌ·Ｌ－１，高糖损伤组加入１０％ 葡萄糖注射液３３ ｍｍｏｌ·Ｌ－１，低、中和高剂量β－Ｃ 组分别加入β－Ｃ１０、２０、４０μｍｏｌ·Ｌ－１＋１０％葡萄糖注射液３３ ｍｍｏｌ·Ｌ－１。各组放置５％ＣＯ２ 培养箱中培养４８ｈ后，收集细胞或培养液进行实验。３）将传代至第３代的血管内皮细胞分为５组：正常对照组、高糖损伤组及低、中和高剂量β－Ｃ 组。
１．２．２ 血管内皮细胞存活率的检测
将５ 组 （传 代至第 ３ 代的血管内皮细胞）用２０％ＤＭＥＭ（含１０％胎牛血清）悬浮细胞后，以每孔１０３ 的 细 胞 数 接 种 于 ９６ 孔 板 培 养 板 中，每 孔２００μＬ，每组接种６ 个复孔。待细胞贴壁后８ｈ 后加药，正常 对照组、高 糖损伤组及低、中 和高剂量β－Ｃ组加药同１．２．１ 段。加药后，放置５％ＣＯ２ 培养箱中培养２４ｈ。培养２４ｈ后，每孔加入 ＭＴＴ 溶液（５ｇ·Ｌ－１ ）１５μＬ，再放置 ５％ＣＯ２ 培养箱中培养４ｈ。培养４ｈ后，小心吸弃孔内培养上清液。
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邱模昌，蔡灵卿，王 芳，刘建明，程畅河
（江西医学高等专科学校药学系，江西 上饶３３４０００）
摘要：目的 研究β－胡萝卜素（β－Ｃ）对高糖诱导的内皮细胞损伤的?；ぷ饔?/span>，并初步探讨其作用机制。方法 在血管内皮细胞长至８０％ 以上融合时，将其分为５组：正常对照组、高糖损伤组及低、中和高剂量β－Ｃ 组，每组６ 个复孔。正常对照组加入１０％ 葡萄糖注射液５．５ ｍｍｏｌ·Ｌ－１ ，高糖损伤组加入１０％ 葡萄糖注射液３３ ｍｍｏｌ·Ｌ－１ ，低、
中和高剂量β－Ｃ 组分别加入β－Ｃ１０、２０、４０μｍｏｌ·Ｌ－１ ＋１０％ 葡萄糖注射液３３ ｍｍｏｌ·Ｌ－１ 。各组放置５％ＣＯ２ 培养箱中培养４８ｈ后，收集细胞或培养液进行实验。使用酶联免疫检测仪、采用 ＭＴＴ 比色法检测５ 组血管内皮细
胞存活率，采用流式细胞仪检测血管内皮细胞凋亡率、血管内皮细胞中活性氧（ＲＯＳ）水平，使用全自动生化仪、采用乳酸→丙酮酸连续监测法检测５组血管内皮细胞培养液中乳酸脱氢酶（ＬＤＨ）活性，使用全自动生化仪、采用硫代巴比妥酸比色定量法检测５组血管内皮细胞培养液中丙二醛（ＭＤＡ）的水平；先参照 ＮＯ 检测试剂盒的使用说明书进行实验，后采用酶联免疫检测仪检测５组血管内皮细胞培养液中 ＮＯ 水平。结果 与正常对照组比较，高糖损伤组的血管内皮细胞存活率、血管内皮细胞培养液中 ＮＯ 水平均明显降低，血管内皮细胞培养液中 ＬＤＨ 活性、
ＭＤＡ 水平，血管内皮细胞凋亡率、血管内皮细胞中 ＲＯＳ水平均明显升高（均 Ｐ＜０．０１）；与高糖损伤组比较，中、高剂量β－Ｃ 组的血管内皮细胞存活率、血管内皮细胞培养液中 ＮＯ 水平均明显升高，血管内皮细胞培养液中 ＬＤＨ 活性、ＭＤＡ 水平及低、中和高剂量β－Ｃ 组的血管内皮细胞凋亡率、血管内皮细胞中 ＲＯＳ水平均明显降低（Ｐ＜０．０５或
Ｐ＜０．０１）。结论 β－胡萝卜素对高糖诱导的脐静脉内皮细胞的损伤具有?；ぷ饔?/span>，其机制可能与增加 ＮＯ 水平和
促进 ＲＯＳ的降解有关。
关键词：糖尿病；β－胡萝卜素；高糖；血管内皮细胞损伤；活性氧；脐静脉；保护作用
中图分类号：Ｒ９６；Ｒ５８７．１ 文献标志码：Ａ 文章编号：２０９５－４７２７（２０１４）０７－００２４－０５
β－胡萝卜素（β－ｃａｒｏｔｅｎｅ，β－Ｃ）是常见类胡萝卜素之一，类胡萝卜素呈现很强的抗氧化性，具有清除
自由基、?；ぱ?/span>、抗肿瘤、护肤、增强免疫功能及保护神经系统等作用。有研究［７］发现，β－Ｃ 能充分提
高 ＮＯ 的水平和生物利用度，舒张血管，保护血管，
同时β－Ｃ 还能抑制 ＲＯＳ水平的升高，保持机体抗氧化能力和不断产生的氧自由基的氧化能力之间的动态平衡，预防动脉粥样硬化等的发生，但β－Ｃ 对高糖
诱导的血管内皮细胞损伤的?；ばвδ壳把芯拷?/span>
少。本研究观察了β－Ｃ 对血管内皮细胞损伤的?；?/span>效应，并从 ＲＯＳ与 ＮＯ 途径探讨β－Ｃ 对血管内皮细胞损伤的?；ばв?/span>。
１ 材料与方法
１．１ 实验材料
人脐静脉内皮细胞株 ＨＵＶＥＣ－１９ 购自中南大学（源自 ＡＴＣＣ 细胞库），ＤＭＥＭ 培养基（上海恒远生物科技有限公司），ＭＴＴ 溶液、Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ、
ＬＤＭＳＯ、乳 酸 脱 氢 酶 （ＬＤＨ ）试 剂 盒 和 丙 二 醛
（ＭＤＡ）试剂盒（海门市碧云天生物技术研究所），
沙长锦应用技术研究所），６５２ 酶联免疫检测仪（美国ＢＩＯ－ＲＡＤ 公司），ＤＸＣ６００全自动生化分析仪（美国 Ｂｅｃｋｍａｎ 公司），ＦＡＣＳＣ－ＡＬＩＢＵＲ 流式细胞仪
（美国ＢＤ 公司）。
１．２ 实验方法
１．２．１ 血管内皮细胞培养与实验分组、加药方法
１）将人脐静脉内皮细胞株 ＨＵＶＥＣ－１９ 传代至第３代后用２０％ＤＭＥＭ（含１０％ 胎牛血清）悬浮细胞，计数后以５×１０３／孔的细胞数接种于六孔板培养板中，待 细胞长至 ８０％ 以上融合时进行实验。
２）在血管内皮细胞长至８０％ 以上融合时，将其分为
５组：正常对照组、高糖损伤组及低、中和高剂量β－Ｃ 组，每组６个复孔。正常对照组加入１０％ 葡萄糖注射液５．５ ｍｍｏｌ·Ｌ－１，高糖损伤组加入１０％ 葡萄糖注射液３３ ｍｍｏｌ·Ｌ－１，低、中和高剂量β－Ｃ 组分别加入β－Ｃ１０、２０、４０μｍｏｌ·Ｌ－１＋１０％葡萄糖注射液３３ ｍｍｏｌ·Ｌ－１。各组放置５％ＣＯ２ 培养箱中培养４８ｈ后，收集细胞或培养液进行实验。３）将传代至第３代的血管内皮细胞分为５组：正常对照组、高糖损伤组及低、中和高剂量β－Ｃ 组。
１．２．２ 血管内皮细胞存活率的检测
将５ 组 （传 代至第 ３ 代的血管内皮细胞）用２０％ＤＭＥＭ（含１０％胎牛血清）悬浮细胞后，以每孔１０３ 的 细 胞 数 接 种 于 ９６ 孔 板 培 养 板 中，每 孔２００μＬ，每组接种６ 个复孔。待细胞贴壁后８ｈ 后加药，正常 对照组、高 糖损伤组及低、中 和高剂量β－Ｃ组加药同１．２．１ 段。加药后，放置５％ＣＯ２ 培养箱中培养２４ｈ。培养２４ｈ后，每孔加入 ＭＴＴ 溶液（５ｇ·Ｌ－１ ）１５μＬ，再放置 ５％ＣＯ２ 培养箱中培养４ｈ。培养４ｈ后，小心吸弃孔内培养上清液。
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