目前引物合成基本采用固相亞磷酰胺三酯法。DNA合成儀有很多種， 主要是由ABI/PE 公司生產(chǎn)。合成的原理基本相同，主要差別在于合成產(chǎn)率的高低、試劑消耗量和單個(gè)循環(huán)用時(shí)的不同。

        亞磷酰胺三酯法合成DNA片段，具有、快速偶聯(lián)以及起始反應(yīng)物比較穩(wěn)定的特點(diǎn)。該方法是在固相載體上完成DNA鏈的合成的，合成的方向是沿待合成引物的3‘端向5‘端合成，相鄰的核苷酸通過(guò)3‘→5‘磷酸二酯鍵連接。

    *步，三氯乙酸和預(yù)先連接在固相載體（CPG）上的核苷酸反應(yīng)（其活性基團(tuán)處于被保護(hù)狀態(tài)），脫去核苷酸5‘-羥基的保護(hù)基團(tuán)DMT，獲得游離的5‘-羥基；

    第二步，合成DNA的原料（亞磷酰胺保護(hù)的核苷酸單體）與活化劑四氮唑混合，得到核苷亞磷酸活化中間體，它的3‘端被活化，5‘-羥基仍然被DMT保護(hù)，與溶液中游離的5‘-羥基發(fā)生縮合反應(yīng)；

    第三步，帶帽（capping）反應(yīng)，縮合反應(yīng)中可能有極少數(shù)5‘-羥基沒有參加反應(yīng)（少于2%），用乙酸酐和1-甲基咪唑終止其后繼續(xù)發(fā)生反應(yīng)，這種短片段可以在純化時(shí)分離掉；

    第四步，在氧化劑碘的作用下，亞磷酰形式轉(zhuǎn)變?yōu)楦€(wěn)定的磷酸三酯。

    經(jīng)過(guò)以上四個(gè)步驟，一個(gè)脫氧核苷酸被連接到固相載體的核苷酸上。再以三氯乙酸脫去它的5‘-羥基上的保護(hù)基團(tuán)DMT，重復(fù)以上步驟，直到所有要求合成的堿基被接上去。合成過(guò)程中可以觀察TCA處理階段的顏色判定合成效率。

    通過(guò)氨水高溫處理，連接在CPG上的引物被切下來(lái)，通過(guò)OPC, PAGE等手段純化引物，成品引物用C18濃縮、脫鹽，測(cè)定OD260定量，根據(jù)定單要求分裝。