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ELISA的基本原理-抗原抗體的免疫化學(xué)
點(diǎn)擊次數(shù)：2717 發(fā)布時(shí)間：2011-3-2
ELISA的基本原理
酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）顧名思義就是以酶作為標(biāo)記指示物、以抗原抗體免疫反應(yīng)為
基礎(chǔ)的固相吸附測(cè)定方法。因此，一個(gè)ELISA測(cè)定試劑，其有機(jī)組成部分包括三個(gè)方面，即固相支持物及包被的抗原或抗體、酶標(biāo)記的抗體或抗原和酶反應(yīng)底物等。抗原或抗體的固相化并不影響其免疫結(jié)合活性，酶標(biāo)記的抗體或抗原亦是如此，并且標(biāo)記酶的活性不因標(biāo)記過(guò)程而喪失。整個(gè)測(cè)定中，抗原抗體結(jié)合反應(yīng)在固相支持物上進(jìn)行，反應(yīng)結(jié)果的判斷以酶與其底物作用后的顯色或產(chǎn)生熒光或發(fā)光反應(yīng)為準(zhǔn)則，顯色或產(chǎn)生熒光或發(fā)光的強(qiáng)度與臨床標(biāo)本中待測(cè)物的濃度成正比或反比關(guān)系。目前國(guó)內(nèi)的ELISA試劑盒均以酶的顯色反應(yīng)來(lái)完成測(cè)定。
固相上抗原抗體相互作用的免疫化學(xué)
固相上抗原抗體結(jié)合反應(yīng)所需要的時(shí)間 通常，固相免疫測(cè)定如ELISA中抗原抗體結(jié)合達(dá)到平衡所需要的時(shí)間，要大于液相免疫測(cè)定，并隨液體所占體積與界面抗體或抗原受體所占體積比的增加而增加。當(dāng)在微孑L板孔內(nèi)進(jìn)行免疫測(cè)定時(shí)，界面反應(yīng)動(dòng)力學(xué)顯示其對(duì)擴(kuò)散作用有很強(qiáng)的依賴(lài)性，擴(kuò)散性越強(qiáng)則反應(yīng)所需時(shí)間越短，結(jié)合越充分。這一點(diǎn)可通過(guò)旋轉(zhuǎn)振蕩來(lái)達(dá)到，微孔的旋轉(zhuǎn)振蕩可促使液體進(jìn)入到可與抗體或抗原包被界面接觸的較小的區(qū)域內(nèi)。也可在微孔中放一個(gè)惰性的塞子以使反應(yīng)液體成為一個(gè)小體積，或使用一個(gè)具有大表面的多孔的基質(zhì)如硝酸纖維素，或使用微顆粒來(lái)做到這一點(diǎn)。微顆粒小于lum時(shí)，在測(cè)定時(shí)即成膠體懸液，而當(dāng)顆粒或珠較大時(shí)，則會(huì)在沒(méi)有振蕩時(shí)，由于重力的作用而分開(kāi)。所有上述方法均是通過(guò)減少液體所占體積與界面抗體或抗原受體所占體積比，從而減少固相免疫測(cè)定的擴(kuò)散依賴(lài)性。
反應(yīng)體積 此處的反應(yīng)體積并非是微孔中的液體體積，而是固相免疫測(cè)定中與固相包被的抗體或抗原有接觸的部分，這部分體積到底有多少，很難測(cè)定，但比反應(yīng)管中總液體體積要少得多。固相抗原抗體反應(yīng)發(fā)生于液體—固相界面，可能處于一級(jí)結(jié)合鍵的引力距離內(nèi)，小于10nm。液相中待測(cè)抗原或抗體要進(jìn)入到這個(gè)結(jié)合界面，需要擴(kuò)散或質(zhì)量轉(zhuǎn)移。微顆粒的反應(yīng)表面區(qū)域較微孑L要大得多，因而處于抗原抗體結(jié)合界面的體積占總反應(yīng)體積的比例亦高得多。因此，結(jié)合反應(yīng)的效率更高。這也是全自動(dòng)化免疫測(cè)定分析儀均采用微顆粒固相的重要原因之一?？蓞⑴c結(jié)合反應(yīng)的抗體或抗原的濃度取決于可參與結(jié)合的反應(yīng)體積，這無(wú)法計(jì)算。這一點(diǎn)使得使用通常的質(zhì)量作用定律圖形的Keq的計(jì)算變得復(fù)雜化，因此，固相抗原抗體反應(yīng)的KeQ值與液相抗原抗體反應(yīng)的Keq值沒(méi)有可比性。
微孔內(nèi)特異抗體的免疫測(cè)定 使用吸附的復(fù)雜抗原進(jìn)行微孔內(nèi)特異抗體的免疫測(cè)定，
與液相測(cè)定相比，有明顯的親和力依賴(lài)性，固相受體—配體相互作用的穩(wěn)定性似乎與微孔內(nèi)特異抗體的免疫測(cè)定親和力依賴(lài)性和極低比例的所捕獲的總抗體相矛盾