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免疫組化常見問題的處理

最近更新時間：2011-3-17

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免疫組化常見問題的處理

      當(dāng)免疫組化染色沒有出現(xiàn)預(yù)期結(jié)果時，應(yīng)系統(tǒng)地查找原因，而每一次只能排除一種可能的原因。 對照/標(biāo)本無染色    ① 確認(rèn)是否忽略了應(yīng)該加的某種試劑，包括一抗、二抗、三抗及底物等。    ② 確認(rèn)所有的試劑是否按正確的順序加入，是否孵育了足夠的時間。    ③ 對照抗體的標(biāo)簽確認(rèn)是否使用了正確的抗體，以及所用的檢測系統(tǒng)是否和一抗匹配，這一點是非常重要的。比如，如果一抗是兔來源的抗體，二抗一定要用抗兔的二抗來匹配；或一抗是小鼠的IgM一抗，二抗必須是山羊/兔抗小鼠的IgM（不是IgG）二抗。    ④ 檢查抗體所使用的稀釋度及稀釋溶液。    ⑤ 檢查抗體的有效期和保存條件，尤其是標(biāo)記了酶或熒光素的抗體，現(xiàn)在大多數(shù)試劑公司的抗體均要求在4~8℃條件下保存，應(yīng)避免反復(fù)凍融，試劑保存時一定要避免與揮發(fā)性有機溶劑同放一室，以免降低抗體的效價。      

① 標(biāo)本的固定方式，不當(dāng)?shù)墓潭ǚ绞交蚬潭〞r溫度過高，都會影響到所檢測的抗原的數(shù)量和質(zhì)量。    ② 不適當(dāng)?shù)目乖迯?fù)方式，由于石蠟切片在制作的過程中固定劑對抗原的封閉作用，必須用抗原熱修復(fù)或酶消化或兩種同時使用的抗原雙暴露法，至于使用哪一種方法，應(yīng)參照的說明，同時結(jié)合標(biāo)本的具體情況而定。    ③ 抗體的稀釋度是否過高或者孵育的溫度/時間是否正確。一般試劑都會對試劑給出一定的使用范圍，但是由于使用者的標(biāo)本來自各種組織，處理過程也不盡相同，所以應(yīng)參照使用范圍，對所使用的一抗進行梯度測試，找出*的使用濃度。    ④ 切片上了過多的沖洗液，當(dāng)抗體加至切片上時，等于人為地對抗體進行了進一步的稀釋。    ⑤ 孵育時切片是否放置水平，否則會導(dǎo)致抗體流失。如果陰性對照沒有反應(yīng)，陽性對照反應(yīng)良好，而標(biāo)本弱陽性，則可能是由于陽性對照不是同一種組織、或固定方式不同等原因所致。非特異性染色   

① 是否有效地去除了內(nèi)源性酶和生物素。應(yīng)注意的是，并不是每一種組織均需要進行此步驟，但對于內(nèi)源性酶或生物素豐富的組織，如肝臟、腎臟等，需考慮此原因。處理的方法為： 滅活堿性磷酸酶：zui常用的方法是將左旋咪唑（24mg/m1）加入底物液中，并保持pH值在7.6~8.2，即能除去大部分內(nèi)源性堿性磷酸酶，對于仍能干擾染色的酸性磷酸酶，可用50mmol/L的酒石酸抑制。飽和處理內(nèi)源性生物素：消除內(nèi)源性生物素的方法是事先滴加親和素，以飽和內(nèi)源性生物素，使之不再有剩余的結(jié)合位點。具體方法是在ABC法或SP法染色前將切片浸于25ug/ml親和素溶液中處理15分鐘，PBS清洗15分鐘后即可染色。    ② 是否選擇使用了正確的封閉血清。電荷吸附所造成的非特異性背景染色消除方法是以二抗動物的非免疫血清，用PBS稀釋為3%-10%溶液孵育切片，以封閉吸附位點。有時其它無關(guān)蛋白，如牛血清白蛋白也常應(yīng)用。另外，取材時避開出血、壞死區(qū)亦極重要。zui近有些國內(nèi)的實驗室應(yīng)用5%脫脂奶粉替代血清進行抗原封閉，效果也不錯。    ③ 所選擇的抗體是否符合試驗要求。因抗原不純、標(biāo)本片中含有與靶抗原相似的抗原決定簇等原因造成的非特異性染色只能通過采用高純度、價的抗體、或針對更具特異性抗原決定簇的單克隆抗體來解決。    ④ 一抗的使用濃度是否過高。    ⑤ 清洗是否充分。應(yīng)嚴(yán)格操作規(guī)程。因在緩沖液中含有一定量的鹽，這亦有利于減低背景著色，通常0.05mol/l Tris—HCl，0.15mol/l NaCl已適用于多數(shù)染色方法，溶液內(nèi)加入吐溫20，效果更佳。特殊標(biāo)記時，試劑公司一般都提供緩沖液的配方。    ⑥ DBA的使用是否正確。DAB的孵育時間和配制方式可以產(chǎn)生某些背景顏色，使用濃縮型DAB試劑盒時，請嚴(yán)格按照說明書標(biāo)明的滴加順序操作，注意校正蒸餾水的pH值，以確保實驗結(jié)果的正確性；粉劑DAB溶解時，常有一些不溶性顆粒，這些顆粒須經(jīng)過濾除去，否則可能沉積于切片組織上，產(chǎn)生斑點狀著色。另外，DAB保存不妥產(chǎn)生氧化物亦可沉積于切片上，因此需將DAB保存于避光干燥處，現(xiàn)用現(xiàn)配，臨用前加H2O2。孵育時間過長也會造成背景染色。    ⑦ 標(biāo)本染色過程中是否曾經(jīng)干涸，否則會造成邊緣部的非特異性染色。    ⑧ 檢查二抗與標(biāo)本的內(nèi)源性組織蛋白是否有交叉反應(yīng)。  1、染色過強 原因  解決辦法 抗體的濃度過高或抗體孵育時間過長 降低抗體滴度（一般指濃縮性抗體）抗體孵育時間：室溫1小時或4℃過夜 孵育溫度過高，孵育溫度超過37℃ 一般室溫20-28℃ DAB顯色時間過長或DAB濃度過高 顯色時間不能超過5-10分鐘，以顯微鏡下觀察為準(zhǔn) 2、非特異性背景染色  原因 解決辦法 操作過程中沖洗不充分 每步?jīng)_洗3×5 組織中含過氧化物酶未阻斷 可再配置新鮮3%H2O2封閉，孵育時間延長 組織中含內(nèi)源性生物素  正常非免疫動物血清再封閉 血清蛋白封閉不充分 延長血清蛋白封閉時間 3、染色弱  原因 解決辦法 抗體濃度過低，孵育時間過短 提高抗體濃度，孵育時間不能少于60分鐘 試劑超過有效使用期 及時更換試劑 操作中，滴加試劑時緩沖液未瀝干，致使試劑稀釋 每步滴加試劑前瀝干切片中多余的緩沖液（但防止切片干燥） 室溫太低，低于15℃    

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