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檢測雜交的蛋白
點擊次數：935 發(fā)布時間：2016-2-3
（一）檢測雜交的蛋白
這項試驗zui后的步驟是檢測能夠特異性地和已經固定在膜上的樣品蛋白發(fā)生相互作用的探針蛋白。為了得到的結果，我們應該盡可能的取得信/噪比zui大的結果，也就是說，我們需要在得到盡可能強的結果的同時盡可能避免背景的產生。根據我們的經驗，非特異性背景結果的顯現(xiàn)和曝光時間是成線型關系的。ELISA試劑盒
具體步驟：
1.將印跡有蛋白的硝酸纖維素膜加上增強化學熒光顯影劑，孵育60s。
2.將過量的增強化學熒光顯影劑從膜上吸去，并將硝酸纖維素膜鋪放于清潔塑料膜上（比如保鮮膜）。
3.將塑料膜平整放入自顯影片盒中。
4.進入暗室，將一張底片放于放射自顯影片盒中與印跡膜及塑料膜疊放后蓋上片盒。
5.根據*次結果信號的強弱調整壓片曝光的時間，一般為5--20s。ELISA試劑盒
6.在標準的洗片機中沖洗膠片。
出于安全的考慮，很多時候研究人員也會采用抗GST的抗體來檢測探針是否能發(fā)生與待測蛋白的相互作用。但是由于容易發(fā)生假陽性，所以必須在蛋白印跡的清洗步驟中反復摸索出合適的條件。在zui后顯色時，也要爭取的信/噪比。
（二）膜結合蛋白的再折疊（選用）
由于被印跡到膜上的蛋白質經過了很多步驟，往往自身已經失去了自然狀況下的構象，或者在其被原核表達的過程中，得到的蛋白就已經是以錯誤的折疊方式存在。這種情況下會出現(xiàn)我們所不愿意看到的假陰性結果。為了zui大可能的避免這種假陰性，在沒有出現(xiàn)陽性結果的時候，有時候我們需要采用再折疊的方法對膜結合蛋白進行處理。
具體步驟：
1.在蛋白轉膜以后用50ml的變性緩沖液在4℃輕輕震蕩清洗有蛋白印跡的膜10min。注意，變性緩沖液要*覆蓋到膜的各個部位。
2.從容器中去除25ml變性緩沖液，按照1∶1比例加入堿性緩沖液進行稀釋，再將膜放入后4度輕輕震蕩洗滌帶有蛋白印跡的膜10min。
3.重復以上步驟4遍。ELISA試劑盒
4.進入上述雜交的程序，視結果而決定是否還需要進一步的重復本步驟。