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鑒定PCR擴增產(chǎn)物的實驗步驟
點擊次數(shù)：1259 發(fā)布時間：2016-1-13
實驗原理
瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR擴增產(chǎn)物。（原理參照瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA實驗）
本實驗使用了TaKaRa公司的膠純化試劑盒（Agarose Gel DNA Purification Kit），該試劑盒是從瓊脂糖凝膠中回收并純化DNA片段的試劑盒。試劑盒采用了*的凝膠融解系統(tǒng)，結(jié)合DNA制備膜技術(shù)，具有、快速、方便的特點，全套操作只需30min便可完成。使用該試劑盒每次可純化得到多至10µg的DNA片段（100bp～30kb），回收率高達50～80%。本試劑盒回收純化的DNA片段純度高，完整性好，可直接用于連接反應(yīng)、PCR擴增、DNA測序等各種分子生物學(xué)實驗。ELISA試劑盒
經(jīng)膠純化試劑盒回收的DNA片段采用-20℃低溫保存，延緩DNA的降解。
實驗步驟
1. 使用1×TAE緩沖液制作瓊脂糖凝膠，然后對目的DNA進行瓊脂糖凝膠電泳。（參照瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA實驗）
2. 在紫外燈下切出含有目的DNA（約600bp）的瓊脂糖凝膠，用紙巾吸盡凝膠表面的液體。此時應(yīng)注意盡量切除不含目的DNA部分的凝膠，盡量減小凝膠體積，提高DNA回收率。ELISA試劑盒
注意：切膠時請注意不要將DNA長時間暴露于紫外燈下，以防止DNA損傷。
3. 切碎膠塊。膠塊切碎后可以加快操作步驟6的膠塊融化時間，提高DNA的回收率。
4. 稱量膠塊重量，計算膠塊體積。計算膠塊體積時，以1mg=1µL進行計算。
5. 向膠塊中加入膠塊融化液DR-I Buffer，DR-I Buffer的加量如下表：
6. 均勻混合后75℃加熱，融化膠塊（低熔點瓊脂糖凝膠只需在45℃加熱）。此時應(yīng)間斷振蕩混合，使膠塊充分融化（約6～10分鐘）。
注意：膠塊一定要充分融化，否則將會嚴(yán)重影響DNA的回收率。
7. 向上述膠塊融化液中加入DR-I Buffer量的1/2體積量的DR-II Buffer，均勻混合。當(dāng)分離小于400 bp的DNA片段時，應(yīng)在此溶液中再加入終濃度為20%的異丙醇。
8. 將試劑盒中的Spin Column安置于Collection Tube上。
9. 將上述操作7的溶液轉(zhuǎn)移至Spin Column中，12000 rpm離心1min，棄濾液。
注意：如將濾液再加入Spin Column中離心一次，可以提高DNA的回收率。
10. 將500 µL的Rinse A加入Spin Column中，12000 rpm離心30s，棄濾液。
11. 將700 µL的Rinse B加入Spin Column中，12000 rpm離心30s，棄濾液。
12. 重復(fù)操作步驟11。
13. 將Spin Column安置于新的1.5 mL的離心管上，在Spin Column膜的中央處加入25 µL的滅菌蒸餾水或Elution Buffer，室溫靜置1min。ELISA試劑盒