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NK細(xì)胞的殺傷活性檢測(cè)
點(diǎn)擊次數(shù)：2293 發(fā)布時(shí)間：2016-1-4
(一)原理
以NK細(xì)胞為例。將待測(cè)者外周血中的NK細(xì)胞與靶細(xì)胞(K562細(xì)胞)按一定比例混合培養(yǎng)一定時(shí)間，NK細(xì)胞作用于靶細(xì)胞，使靶細(xì)胞被殺死、破壞，進(jìn)而使靶細(xì)胞線粒體內(nèi)的乳酸脫氫酶釋放出來．使底物發(fā)生顏色變化，其顏色深淺與酶的釋放量成正比，檢測(cè)顯色后的光密度OD值，便可推算出NK細(xì)胞的殺傷活性。
(二)材料
1．待檢者肝素抗凝血，靶細(xì)胞為K562細(xì)胞。
2．RPMI 1640培養(yǎng)液、淋巴細(xì)胞分離液。
3．酶標(biāo)儀、離心機(jī)。
(三)方法
1．用含5％小牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液將靶細(xì)胞調(diào)整到5×104～2×105／ml，此濃度需根據(jù)情況預(yù)先標(biāo)定。
2．取待檢者肝素抗凝血3～5ml，經(jīng)淋巴細(xì)胞分離液分離單個(gè)核細(xì)胞，為效應(yīng)細(xì)胞。
3．在96孔圓底細(xì)胞培養(yǎng)板中加入靶細(xì)胞，每孔加100μl。3個(gè)效應(yīng)細(xì)胞自然釋放對(duì)照孔不加靶細(xì)胞．只加100μl培養(yǎng)液。
4．向各孔加：100μl效應(yīng)細(xì)胞，效應(yīng)細(xì)胞與靶細(xì)胞的比例根據(jù)要求而定，通常為5：l～20：1。自然釋放孔不加效應(yīng)細(xì)胞只加100μl培養(yǎng)液，zui大釋放孔中加100μl1％NP40。每個(gè)實(shí)驗(yàn)設(shè)3個(gè)復(fù)孔。
5．置37℃5％CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4～6h。
6．離心培養(yǎng)板1000r／min離心10min。每孔吸出150μl上清液．對(duì)應(yīng)加入另一塊96孔酶聯(lián)檢測(cè)板中。向第二塊板每孔依次加20μl O．4mol／L乳酸溶液、20ml 4mmol／L 2一p一碘苯酯一3一p一氯化硝基苯四唑，20μl反應(yīng)液[含O．03％BSA．2．7U／m1硫辛酰胺脫氫酶．4．5mmol／L氫化型輔酶I(NAD+ )，1．2％蔗糖的PBS]，室溫中放置20min。
7．在酶聯(lián)檢測(cè)儀上測(cè)定各孔的光密度(OD值)，檢測(cè)波長(zhǎng)492nm，參考波長(zhǎng)650nm；