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抗腫瘤藥物敏感性檢測實驗方法
點擊次數：2083 發(fā)布時間：2015-12-31
抗腫瘤藥物敏感性檢測實驗方法繁多，大體上分為體內和體外兩類方法。各種方法各有其優(yōu)點和局限性，使用某一種方法難以確定藥物抗癌作用，應根據實際情況選擇適當的方法。本章分別介紹體外抗腫瘤藥物敏感試驗及體內抗腫瘤藥物敏感試驗。其中，體外抗腫瘤藥物敏感試驗包括四噻唑藍法藥物敏感試驗、致死細胞染色法藥敏試驗、3 H—TdR摻人法藥物敏感試驗、染料排斥試驗法、生長曲線測定法、集落形成試驗法和三磷酸腺苷生物發(fā)光法。體內抗腫瘤藥物敏感試驗包括裸鼠移植瘤試驗和小鼠腎包膜下腫瘤移植試驗。
腫瘤患者常因腫瘤病因和類型不同以及個體差異的原因，對化療藥物的敏感性有很大差異。為了減少臨床選擇化療藥物的盲目性，實行個體化治療，化療前預測腫瘤細胞對化療藥物的敏感性至為重要。腫瘤細胞化療藥物敏感性的主要指標是細胞數量的增減。但是這一指標不能顯示細胞的死亡和存活方面的信息，而用活細胞數量的增減來表達腫瘤細胞對化療藥物敏感性更為恰當。目前檢測腫瘤細胞存活狀況的主要方法為臺盼藍拒染法、四噻唑藍(methvlthiazolete trazoliunl，MTT)法和放射性同位素摻人法。臺盼藍拒染法由于其指標判斷人為因素較多，較少應用。而MTT法能客觀、準確地反映細胞的存活狀態(tài)，故較常應用。
(一)四噻唑藍法藥物敏感試驗
1．試驗原理在正常情況下，細胞線粒體進行三羧酸循環(huán)過程中，琥珀酸脫氫酶能催化琥珀酸脫氫，并氧化成延胡索酸；而MTT可接受脫下來的H+ ，使可溶性的黃色MTT變成難溶性、紫藍色的沉淀，并沉積在細胞中，而死的細胞則無此功能。再用DMSO溶解縈色的沉淀，在酶標儀下測定其吸光度A值，即可計算出存活細胞數。該方法具有快捷、方便、靈敏、經濟的特點，并與臨床治療有較好的一致性。MTT快速比色法已被推薦為抗癌藥物的篩選方法。
2．材料
(1)待檢藥物：待測定的化療藥物。
(2)細胞：臨床腫瘤細胞的主要來源是由外科手術獲取。將切下的腫瘤組織立即放人裝有培養(yǎng)液的無菌凍存管中，4℃保存，12h內使用。也可以是體外培養(yǎng)的細胞株。
(3)試劑：MTT(用pH7．2～7．4的PBS現用現配成5mg／ml MTT，或配好后避光4℃儲存，備用l周)、含10％CS的RPMI 1640培養(yǎng)液(內含100 U／ml青霉素和100μg/ml鏈霉素)、Halaks液、DMSO、O．1％膠原蛋白酶、O．25％胰蛋白酶一O．02％EDTA、HBSS。
(4)器材：無菌的96孔培養(yǎng)板、手術剪、100目和200目不銹鋼網、培養(yǎng)皿、離心管、加樣槍及槍頭、酶標儀等。
3．實驗方法
(1)無菌條件下剔除壞死及非腫瘤組織，用Hanks液沖洗1次。
(2)用下述方法之一將腫瘤組織分散為單細胞：
1)機械分散法：充分剪碎腫瘤組織，經100目和200目不銹鋼網擠壓過濾，收集細胞。
2)酶消化分散法：充分剪碎腫瘤組織，首先經o．1％膠原蛋白酶37℃下消化20min，再用O．25％胰蛋白酶一O．02％EDTA混合液(1：1)37℃下消化，收集細胞。
(3)將分散的細胞懸液加入含100％和75％淋巴細胞分離液的梯度離心管中，2000r／min離心20min，吸取zui上層(75％分離液的界面上)的腫瘤細胞。
(4)用Hanks液離心洗滌2次，棄上清液，加入適量培養(yǎng)液重新懸浮細胞。
(5)立即將腫瘤細胞懸液以每孔103～104個細胞接種于96孔培養(yǎng)板(200μl／孔)，同時加入事先確定濃度梯度的各組抗癌藥10μl／孔(對照組加入培養(yǎng)液10μl／孔)。在37℃、5％CO2孵箱中培養(yǎng)48～72h(培養(yǎng)時間取決于實驗的目的和要求)。
(6)每孔加入MTT(5mg／m1)20μl，37℃作用4h。
(7)小心吸棄各孔內的上清液，對于懸浮生長的細胞需1000r／min離心5min，然后再吸棄上清液。每孔加入DMSO 150μl，振蕩，使紫藍色沉淀充分溶解，用酶標儀在波長450～600nm處測定吸光度A值。
(8)各藥物濃度組設3個平行孔，實驗重復3次，取平均值計算藥物作用后腫瘤細胞生長抑制率。
4．結果分析若實驗組的細胞生長抑制率大于50％，即表明藥物有效。