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人GFAP 免疫組化試劑盒
點(diǎn)擊次數(shù)：1106 發(fā)布時(shí)間：2015-12-18
人GFAP 免疫組化試劑盒
該試劑盒以HRP 標(biāo)記的鏈霉親和素復(fù)合物（HRP Streptavidin Conjugate，HRP-SA）為基礎(chǔ)，可用于檢測(cè)細(xì)胞、組織內(nèi)的特異性GFAP 抗原。該試劑盒具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、定性定位準(zhǔn)確、背景清晰。在所用的GFAP 一抗與相應(yīng)靶抗原結(jié)合后，用生物化二抗與一抗特異性結(jié)合，zui后加入HRP-SA，形成抗原—特異一抗—生物素化二抗—HRP-SA 復(fù)合物，顯微鏡下觀察成像。
試劑盒所含試劑：
試劑A 通透液：0.1% Triton-X 100 10 mL（選用）
試劑B 封閉緩沖液（封閉用） 20 mL
試劑C （*分裝）已稀釋的即用型GFAP 一抗（2.5ml）
試劑D （*分裝）生物素化羊抗兔IgG 1 支（濃度1.5 mg/mL，稀釋比為1:300~1:500）100 μL+抗體稀釋液20ml
試劑E HRP-SA 復(fù)合物1 支（濃度1 μM，稀釋比1:50~1:200）100 μL
試劑F DAB 顯色液5ml
用戶自備試劑：
1． 10mM TBS（pH7.2~7.4）三羥基氨基甲烷1.21g氯化鈉7.6g加蒸餾水800mL，濃鹽酸調(diào)pH 值至7.2~7.4，zui后定容至1000mLTBS-T：TBS+Tween 20（0.05%體積比）
2．抗原修復(fù)液（依檢測(cè)抗原不同而選擇不同的修復(fù)液）10mM pH6.0 檸檬酸緩沖液檸檬酸0.38g檸檬酸三鈉2.45g加蒸餾水900mL，濃鹽酸調(diào)pH 值至6.0，zui后定容至1000mL或：0.5M EDTA 修復(fù)液（pH8.0）EDTA·2H2O 186.1g檸檬酸三鈉2.45g加蒸餾水700mL，用10mM NaOH 調(diào)pH 值至8.0，zui后定容至1000Ml
3. 緩沖甘油封固劑10 mL
4. Tween 20 5 mL
石蠟包埋組織切片免疫染色
實(shí)驗(yàn)步驟（建議方案）：
石蠟包埋組織切片3~4μm 厚度
1.烤片： 將待做切片置于切片架上，于60℃恒溫烤箱中至少烤1 hr；
2.脫蠟： 切片放入盛有二甲苯的容器中脫蠟3 次（即二甲苯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ），每次10 min；
3.水化： 切片經(jīng)下行酒精水化，無水乙醇5min，95%乙醇2 次（每次2min），85%乙醇2 min；75%乙醇2min，自來水沖洗，ddH2O 洗2×2min；
4.抗原修復(fù)： 根據(jù)抗體說明書推薦方法進(jìn)行抗原修復(fù)，常采用高壓、微波（溫度達(dá)到98~100℃）或酶消化修復(fù)法，室溫自然冷卻，自來水沖洗，ddH2O 洗2×
2min，TBS 洗滌（2×2min）（具體修復(fù)方法見附1）* 注：有些抗原勿需修復(fù)，直接進(jìn)入第5 步封閉。
5.封閉： 滴加試劑B，37℃濕盒孵育30 min；
6.加一抗：滴加用試劑C（即用型一抗），37℃濕盒孵育2 hr 或4℃；
7.洗滌： TBS-T 洗滌（3×5 min）；
8.封閉： 滴加試劑B，37℃濕盒孵育10 min；
9.加二抗： 滴加用抗體稀釋液稀釋的生物素化二抗（試劑D），37℃濕盒中孵育30 min；
10.洗滌： TBS-T 洗滌（3×5 min）；
11.封閉： 滴加試劑Tween 20，37℃濕盒孵育封閉20 min；
12.加HRP-SA： 滴加用試劑C 稀釋的試劑E（1：50~200，終濃度5~20 nM），37℃濕盒中孵育30 min；
13.洗滌： TBS-T 洗滌（3×5 min），TBS 洗滌（2×5 min）；
14.顯色：應(yīng)用DAB 溶液（試劑F）顯色；
15.復(fù)染：自來水充分沖洗，復(fù)染，脫水，透明；
16.封片： 待組織標(biāo)本干后，用試劑緩沖甘油封固劑封片；
17.觀察成像： 顯微鏡下觀察成像。抗原
注意事項(xiàng)：
1. 修復(fù)后緩沖液須自然冷卻，自來水沖洗后方能把切片取出，驟冷有可能導(dǎo)致結(jié)晶或抗原封閉。
2. 緩沖液的量必須保證所有切片都能浸泡到，用過的檸檬酸緩沖液不能反復(fù)使用。
3. 若試劑為微量濃縮液，用前應(yīng)低速離心，將內(nèi)蓋和管壁附著的溶液離到底部。
4. 封片前一定要換用TBS 充分洗滌，以便洗去組織上殘留的Tween 20，否則會(huì)影響結(jié)果觀察。
5. 如須復(fù)染細(xì)胞核，則在封片前復(fù)染或直接采用含有染核試劑的封片劑進(jìn)行封片。