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細(xì)胞內(nèi)抗原的檢測(cè)過程
點(diǎn)擊次數(shù)：1028 發(fā)布時(shí)間：2015-8-5
細(xì)胞內(nèi)抗原的檢測(cè)過程與細(xì)胞表面抗原檢測(cè)過程基本一致，只是在與一抗孵育前，需要預(yù)先對(duì)細(xì)胞用非離子去污劑進(jìn)行透化處理。
操作方法
1. 取已固定好的細(xì)胞爬片或甩片或經(jīng)過預(yù)處理的組織切片（石蠟或冰凍切片）；
2. 用含0.2%TritonX-100或NP-40的PBS溶液透化固定后的細(xì)胞2min（室溫），有些標(biāo)本可能需要長(zhǎng)達(dá)15min，時(shí)間視抗原而定；
3. 余下步驟接上述“細(xì)胞表面抗原的檢測(cè)-間接免疫熒光法"步驟（2）；
注意事項(xiàng)
1. 在使用前，一抗二抗均應(yīng)測(cè)試其合適的稀釋度。
2. 多聚甲醛的固定是不穩(wěn)定的，標(biāo)本經(jīng)多聚甲醛固定后，應(yīng)再用去污劑處理，如果標(biāo)本在水溶液中浸泡的時(shí)間過長(zhǎng)，則會(huì)使交聯(lián)結(jié)構(gòu)解體。因此，應(yīng)避免固定后的標(biāo)本在水溶液中浸泡的時(shí)間過長(zhǎng)。
3. 信號(hào)微弱的解決方法：
① 提高一抗和二抗的濃度以增強(qiáng)敏感性 ，這必須測(cè)試各種濃度抗體的滴度；
② 延長(zhǎng)一抗和二抗的孵育時(shí)間。由于細(xì)胞染色時(shí)抗原吸附在固相載體上，抗原抗體結(jié)合時(shí)間較在溶液中長(zhǎng)。孵育時(shí)間可因?qū)嶒?yàn)設(shè)計(jì)作適當(dāng)調(diào)整，但少于20min抗體和抗原幾乎不能有效結(jié)合。在以上兩點(diǎn)中，應(yīng)摸索出一個(gè)*條件以產(chǎn)生有效信號(hào)且保持良好的背景。這就需要反復(fù)試驗(yàn)，因?yàn)槊拷M抗體和抗原的情況會(huì)有所不同；
③ 改變檢測(cè)方法，用共聚焦顯微鏡觀察，可提高敏感性。