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抗酶抗体及酶－抗酶复合物的制备
点击次数：1638 发布时间：2012-2-15
抗酶抗体的优点，在于酶和抗体结合时，不需要通过化学交联剂交联，抗体的失活少。在酶复合物形成后，同时就具有酶的活性，遇到相应的底物即呈现催化显色作用。必须注意，抗酶抗体必须用与*抗体同种来源的动物制备。
(一)抗酶抗体的制备
于家兔的两个后足掌内各注入弗氏*佐剂(含活卡介苗12mg/ml)和过氧化物(5mg/ml)
的等量混合乳化液0.5ml，两星期后，于两侧腘淋巴结内注入同样液体。一周后静脉注射0.2ml~0.4ml，过氧化物酶液(同样浓度), 并同样强化2－3次,末次注射后一周验血、分离血清即为过氧化物酶抗体。
(二)酶－抗酶复合物(PAP)的制备
1．取单价特异性抗酶血清10ml，1.5×104r/min(4℃)离心20min，吸取上清。
2．于上清液中滴加酶溶液(0.5mg/ml)直至不再产生沉淀,静置1h，1.5×104r/min离心20min。
3．将沉淀物用冷生理盐水125ml洗三次，每次1.5×104r/min离心20min。
4．于冰浴下，将沉淀物悬混于4ml HRP(2mg/ml)中。
5．在pH计监测下，边搅拌边加0.1Mol/L或0.01Mol/L HCl至pH 2.3。此时沉淀已全部溶解，1.5×104r/min离心20min。
6．吸取上清，用0.1Mol/L NaOH调pH至7.4。
7．量体积，加入1/10容量的0.075Mol/L醋酸钠和0.15Mol/L醋酸铵的等量混合液。
8．逐滴加入等体积的100%饱和硫 酸铵，搅拌20min。1.5×104r/min离心20min。
9．将沉淀物用50%饱和硫 酸铵洗1次，同样离心。
10．将沉淀物悬混于5ml蒸馏水中，以pH6.75缓冲盐水透析3天，每天换水1次。(缓冲盐水由1.35×104ml生理盐水, 25ml 1.5Mol/L醋酸钠和75ml 2Mol/L醋酸铵配成)。
11．1.5×104r/min(4℃)离心20min，吸取上清，于OD280nm和OD403nm测定,计算IgG和酶含量及克分子比值。
12．按0.1ml分装，-20℃保存。
13．应用时从低温冰箱中取出,立即在37℃水浴中融化