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為您帶來ELISA實驗優(yōu)化做到這五點,下個大神就是您!
點擊次數(shù)：1534 發(fā)布時間：2019-8-19
為您帶來ELISA試劑盒實驗優(yōu)化做到這五點,下個大神就是您!
一、封閉液、洗滌液及保護液的優(yōu)化
1.封閉液的優(yōu)化：采用文獻報道的方法進行封閉。其封閉液的組成為：10mM磷酸鹽緩沖液含1%的牛血清白蛋白(BSA)。
2.洗滌液的配制：采用文獻報道的方法配制洗滌液。
3.酶標板保護液的優(yōu)化：酶標板經(jīng)過封閉后在低溫下僅能存放2周左右，為了延長固相酶標板上抗原的穩(wěn)定性，我們增加了一步保護酶標板的程序。在10mM的磷酸鹽中加入適量的糖、無關(guān)蛋白質(zhì)、慶大霉素以及二價金屬離子，作為酶標板保護劑，在封閉完后加入保護液于4℃冰箱中孵育放置一個晚上，同時與未做保護的酶標板進行對照，然后將保護的及未保護的酶標板置于37烘箱中放置15天，考察保護液對酶標板的穩(wěn)定性的影響。
二、酶標抗體稀釋度的優(yōu)化
抗原包被濃度為4ug/ml,將酶標抗體做系列稀釋：1:100，1:200；1:300；1:400；1:500；1:600；1:1000；經(jīng)孵育、洗滌后、顯色終止后，用自動酶標儀分析，選擇A值為1.5左右的酶標抗體稀釋度為zui適工作濃度。
三、底物液的優(yōu)化
常用的作為酶聯(lián)免疫吸附試劑有OPD和TMB系統(tǒng)，由于OPD有致癌的危險性以及用前需要溶解等諸多缺點，因此我們選用TMB作為底物系統(tǒng)，采用文獻報道的方法：取適量的TMB溶解在DMSO中，然后加入適量的超純水，配制作為底物B液；溶解適量的過氧hua氫尿素于100mM磷酸-檸檬酸緩沖液中，配制作為底物A液，用前將底物A液及底物B液等體積混合。在文獻報道的基礎(chǔ)上，上海樊克適當調(diào)整了TMB的用量以及過氧hua氫尿素的用量，并加入了酶促進劑，與文獻報道的底物進行比較。實驗方案為：將活化的辣根過氧hua物酶分別作1:1000；1:10000；1:100000；1:200000；1:400000；1:800000等系列稀釋，比較兩種不同配方的底物的靈敏度。
四、抗原抗體反應(yīng)時間的優(yōu)化：
抗原抗體反應(yīng)會隨著時間的增加，反應(yīng)量也增加，但達到一定的時間后，反應(yīng)即達到平衡，我們?nèi)》磻?yīng)10min，20min，30min，40min，50min，60min，70min,90min等8個點進行比較，以確定zuijia抗原抗體反應(yīng)時間。
五、底物作用時間的優(yōu)化
在其它條件相同的情況下，我們?nèi)?min,10min,15min,20min,25min,30min,35min,40min,50min,60min,80min等11個時間點進行比較，確定zuijia的底物作用時間。