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防腐劑在疫苗生產過程中主要用于抑制微生物生長，是一類重要物質。目前除了硫柳汞外，在生物制品及醫藥防腐劑中還常見如苯酚、間甲酚、2-苯氧乙醇、羥苯甲酯。在《中國藥典》三部（2020 版）中，苯酚按照通則 3113 進行檢測，使用滴定顯色法進行測定，含量應不高于 3.0g/L；間甲酚按照通則 3114 使用比色法進行測定，含量不高于 2.5g/L；2 - 苯氧乙醇按照附錄2液相色譜法進行檢測，應為4.0-6.0mg/mL。

目前不同防腐劑使用不同的檢測方法，對于檢測機構來說方法種類多且工作量大，而滴定法靈敏度及誤差較大，需要工作人員有一定的視覺靈敏度和長期操作經驗。目前亟需開發能同時快速用于生物制品中多種防腐劑的快速檢測方法。

液相色譜儀作為一種常見便捷的色譜分析系統，在含量分析監測中廣泛使用。本文建立了一種采用液相色譜儀對生物制品中苯酚、間甲酚、2 - 苯氧乙醇、羥苯甲酯殘留量同時檢測的分析方法。樣品經乙腈沉淀蛋白后直接進樣分析，前處理簡單、分析速度快、靈敏度高，可供相關檢測人員參考。

1.1 儀器

本實驗采用島津超高效液相色譜儀 LC-40，具體配置為：

系統控制器：CBM-40lite

脫氣機：DGU-20A

輸液泵：LC-40B XRX2

自動進樣器：SIL-40CXR

柱溫箱：CTO-40C

檢測器：SPD-40V

色譜工作站：LabSolutions Ver.5.99

1.2 分析條件

液相色譜條件

色譜柱：Shim-pack GIST C18，2.0μm，100mmx2.1mm；P/N：227-30001-04；

流動相：A-水；B-乙腈

流速：0.4mL/min

柱溫：40℃

進樣體積：5μL

檢測波長：220nm、270nm

洗脫方式：梯度洗脫，B相初始濃度為10%，時間程序見表 1。

1.3 標準溶液制備

以75%乙腈水溶液配制苯酚、間甲酚、2-苯氧乙醇、羥苯甲酯混合標準貯備液 (1000μg/mL)，同時逐級稀釋為 0.5、1、2、5、10、20、50μg/mL共6個標準系列工作溶液，待測。

1.4 樣品前處理

準確取100μL樣品溶液，加入300μL乙腈，渦旋混勻，14000rpm離心5min，上機分析。

2.1 系統適應性和分離度

按照 1.2 中分析條件測試對照品溶液，色譜圖如圖 1 所示。通過梯度洗脫方式，四種化合物分離度良好，且分離度均大于 3（詳見圖 2），滿足液相色譜中關于定量色譜分離度要求。

2.2 專屬性

取空白溶劑進行測定，色譜圖如圖3所示。在 270nm（羥苯甲酯定量通道）和 220nm（苯酚、2-苯氧乙醇、間甲酚定量通道）波長下，對照品（0.5ppm）中四種物質出峰位置處同空白溶劑色譜圖相比均無干擾，專屬性良好。

2.3 線性關系

按照1.3配制 6 個不同濃度的標準系列溶液，按照1.2中的分析條件進行測定。羥苯甲酯以 270nm 作為定量通道，苯酚、間甲酚、2-苯氧乙醇以220nm作為定量通道，以峰面積為縱坐標，濃度為橫坐標，外標法繪制標準曲線。各化合物標準曲線見圖4，線性方程、相關系數和定量限見表2。（請參考文末附件）

2.4 精密度實驗

按照1.2分析條件，分別取0.5μg/mL、20μg/mL對照品溶液上機測試，并計算各化合物保留時間和峰面積的相對標準偏差 (RSD)，以評價系統的檢測結果的重復性。表3結果顯示，目標物保留時間和峰面積的RSD分別在0.07%-0.12%和 0.05%-0.35%之間。精密度實驗結果表明，儀器精密度良好。

2.5 樣品檢測和加標回收實驗

使用本方法檢測了A群C群腦膜炎球菌多糖結合物原液樣品，在陰性樣品中添加標準溶液，配制為兩個不同濃度的加標樣品，每個濃度平行制備三份，按照1.4處理后上機分析，樣品檢測結果和加標回收結果見表4。加標回收率在96.80-101.30%之間，測試結果的RSD在0.05-0.28%之間，方法可靠。