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类黄酮糖基转移酶（UFGT）活性检测试剂盒说明书

微量法

货号：BC5665

规格：100T/96S

产品内容：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致，有疑问请及时联系索莱宝工作人员。

溶液的配制：

1、 提取液：临用前将粉剂一倒入提取液中，此溶液为悬浊液，使用前摇匀即可；

2、 试剂二工作液：：临用前根据样本数量按照试剂一：试剂二=171μL: 9μL（180μL，2T）的比例配制，充分混匀，现配现用；

3、 试剂三 ：临用前加入10 mL蒸馏水溶解，未用完的试剂分装保存，-20℃保存可以保存4周，避免反复冻融；

4、 试剂六：试剂放于试剂瓶内玻璃瓶中。临用前加入6 mL蒸馏水，充分混匀，未用完的试剂分装保存，-20℃保存可以保存4周，避免反复冻融；

5、 试剂七：试剂放于试剂瓶内玻璃瓶中。临用前加入6 mL蒸馏水溶解，未用完的试剂分装保存，-20℃保存可以保存4周，避免反复冻融；

6、 工作液：临用前根据样本数量按照试剂一：试剂四：试剂五：试剂六：试剂七=1.4mL：5μL：2μL：0.3 mL：0.3 mL（2007μL，约7T）的比例配制，充分混匀，现配现用。（试剂四、试剂五使用需先将液体离心至底部使用）

产品说明：

类黄酮糖基转移酶（UDP-glycose flavonoid glycosyltransferase, UFGT）是莽草酸途径的最后一个作用酶，也是使花色素形成稳定的花色苷的第一个作用酶，并使其由无色转为有色；UFGT是果实着色过程中的关键酶，它使不稳定的花色素转变为稳定的花色苷。

UFGT催化UDPG与槲皮素生成UDP和槲皮素糖苷；UDP在丙 酮酸激酶与乳酸脱氢酶作用下，氧化NADH为NAD⁺，NAD⁺生成速度与UDP含量成正比，通过340nm吸光度下降速度反映UFGT活性。

注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

需自备的仪器和用品：

紫外分光光度计/酶标仪、低温离心机、水浴锅/恒温培养箱、分析天平、可调式移液器、微量石英比色皿/96孔UV板、研钵/匀浆器、蒸馏水和冰。

操作步骤：

一、 样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）

1、 组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL提取液），

进行冰浴匀浆。10000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。

二、测定步骤

1、 紫外分光光度计/酶标仪预热30min以上，调节波长至340nm，紫外分光光度计用蒸馏水调零。

2、加样表：首先在1.5mLEP管中按下表步骤加样：

三、类黄酮糖基转移酶（UFGT）活力计算

1、按照蛋白浓度计算

单位的定义：每mg组织蛋白每小时催化1nmol NADH定义为一个酶活力单位。

UFGT活力(U/mg prot ) = ΔA×V反总II÷（ε×d）×10⁹÷ （Cpr ×V样÷V反总I×V上清）÷T×F
= 4019.29×ΔA ÷Cpr×F

2、按样本质量计算

单位的定义：每g组织每小时催化1nmol NADH定义为一个酶活力单位。

UFGT活力(U/g 质量) = ΔA×V反总II÷（ε×d）×10⁹÷（W× V样÷V样总÷V反总I×V上清）÷T×F
 = 4019.29×ΔA÷W×F

V反总I：30℃第一步反应体系总体积（V样+V试剂二工作液+V试剂三），0.2mL；V反总II：37℃第二步反应体系总体积，0.3×10^-3L；ε：NADPH摩尔消光系数，6.22×10³ L/mol/cm；d：石英比色皿或96孔板光径，1cm；

V样：加入样本体积，0.02mL；V上清：第二步反应中上清液体积，0.03 mL；V样总：加入提取液体积，1 mL；T：反应时间，4h；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；F：稀释倍数；10⁹：换算系数，1mol=10⁹nmol。

注意事项：

1、 如果A1测定＜A1空白或者ΔA大于0.5，，可以对上清液进行稀释或者缩短30℃反应时间重新测定；?A＜0.005，可以加大样本量或者延长30℃反应时间重新测定。最终计算时同步修改计算公式。

实验实例：

1、 称取0.1078g洋桔梗，加入提取液进行冰浴匀浆，按照测定步骤操作，用微量石英比色皿测得计算A测定=A1测定-A2测定=0.9988-0.9807=0.0181，A空白=A1空白-A2空白=0.8157-0.8121=0.0036，?A =A测定-A空白= 0.0145。带入公式计算：

UFGT活力(U/g 质量)= 4019.29×ΔA÷W= 540.63 U/g 质量

2、 称取0.1133g洋葱，加入提取液进行冰浴匀浆，按照测定步骤操作，用微量石英比色皿测得计算A测定=A1测定-A2测定=0.8309-0.8157=0.0152，A空白=A1空白-A2空白=0.8157-0.8121=0.0036，?A =A测定-A空白=0.0116。带入公式计算：

UFGT活力(U/g 质量)= 4019.29×ΔA÷W=411.51 U/g 质量

参考文献：

[1] Parvaneh, TaherehAbedi, BahramDavarynejad, Gholam HosseinMoghadam, Ebrahim Ganji. Enzyme activity, phenolic and flavonoid compounds in leaves of Iranian red flesh apple culti vars grown on different rootstocks[J]. Scientia horticulturae, 2019, 246.

[2] Mori K, Sugaya S, Gemma H. Decreased anthocyanin biosynthesis in grape berries grown under elevated night temperature condition[J]. Hort, 2005, 105(3):319-330. 

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