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外切β-1,4-葡聚糖酶/纤维二糖水解酶（C1）活性检测试剂盒说明书

微量法

货号：BC4305

规格：100T/48S

产品组成：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致，有疑问请及时联系索莱宝工作人员。

溶液的配制：

1、 试剂一：临用前取1瓶加入3 mL蒸馏水溶解备用，现用现配；2-8℃保存4周；

2、 标准品：5 μmol/mL 对硝基 苯* 溶液。

产品说明：

β-1,4-葡聚糖酶/纤维二糖水解酶（C1，EC3.2.1.91）存在于细菌、真菌和动物体内，是微生物纤维素降解酶系的主要组分，也是水解天然纤维素的必需组分，C1酶作用于纤维素线状分子的末端，水解β-葡萄糖苷键，每次切下1个纤维二糖分子。

C1能够催化对*纤维二糖苷 (PNPC)生成对硝 基 苯*，后者在400 nm有特征光吸收。

注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

需自备的仪器和用品：

可见分光光度计/酶标仪、天平、台式离心机、水浴锅/恒温培养箱、微量玻璃比色皿/96孔板、可调式移液枪、研钵/匀浆器、EP管。

操作步骤：

一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）

1、组织：按照组织质量（g）: 提取液体积(mL)为1 : 5~10 的比例（建议称取0.1 g 组织，加入1 mL提取液）进行冰浴匀浆。10000g，4℃离心10 min，取上清置冰上待测。

2、细菌、真菌：按照细菌或真菌数量10⁴个 : 提取液体积（mL）500~1000 : 1 的比例（建议500万细菌或真菌加入1mL提取液），冰浴超声波破碎细胞（功率200W，超声3 s，间隔7s，总时间3min）然后10000g，4℃，离心10 min，取上清置冰上待测。

3、血清（浆）等液体：直接测定。

二、测定步骤

1、 分光光度计/酶标仪预热30 min以上，调节波长至400 nm，分光光度计蒸馏水调零。

2、 标准溶液的稀释：取50μL 5 μmol/mL对硝 基 苯* 溶液，加入750μL蒸馏水，充分混匀，配制成0.3125 μmol/mL标准液使用，现用现配。（实验中每管需要20μL，为减小实验误差，故配制大体积。）

3、 操作表（在1.5 mL离心管中依次加入下列试剂）：

    涡旋混匀后室温放置2 min，吸取200 μL于微量玻璃比色皿或96孔板中测定400 nm下的的吸光度，分别记为A测定管、A对照管、A标准管、A空白管。计算ΔA测定=A测定管-A对照管，ΔA标准=A标准管-A空白管。每个测定管需设一个对照管。标准管和空白管只需测1-2次。

三、C1酶活计算

1、按照样本蛋白浓度计算

酶活定义：每mg蛋白在反应体系中每小时生成1 nmol对硝 基 苯*定义为一个酶活力单位。

C1 (U/mg prot) =ΔA测定÷（ΔA标准÷C标）×1000×V样÷（Cpr×V样）÷T=312.5×ΔA测定÷ΔA标准÷Cpr

2、按照样本质量计算

酶活定义：每g样本在反应体系中每小时生成1 nmol对硝 基 苯*定义为一个酶活力单位。

C1 (U/g 质量)= ΔA测定÷（ΔA标准÷C标）×1000×V样÷(V样÷V样总×W)÷T=312.5×ΔA测定÷ΔA标准÷W

3、按照细菌或真菌数量计算

酶活定义：每10⁴个细菌或真菌在反应体系中每小时生成1 nmol对硝 基 苯*定义为一个酶活力单位。

C1 (U/10⁴ cell)= ΔA测定÷（ΔA标准÷C标）×1000×V样÷（细菌或真菌数量×V 样÷V样总）÷T

=312.5×ΔA测定÷ΔA标准÷细菌或真菌数量

 4、按液体体积计算

酶活定义：每毫升液体在反应体系中每小时催化生成1 nmol对 硝基 苯*为一个酶活力单位。

C1 (U/mL)= ΔA测定÷（ΔA标准÷C标）×1000×V样÷V样÷T=312.5×ΔA测定÷ΔA标准

C标：标准溶液浓度：0.3125 μmol/mL；V样：加入的样本体积，0.02 mL；V样总：加入的提取液体积，1 mL；Cpr：上清液蛋白浓度，mg/mL；T：反应时间，1 h；细菌或真菌数量：以万计；W：样本质量，g；1000：换算系数，1 μmol=1000 nmol。

注意事项：

1、若吸光度大于1.5时，建议将样本用提取液稀释后进行测定。计算公式乘以稀释倍数。

实验实例：

1、 取0.1g香菇进行样本处理，离心取上清稀释2倍后按照测定步骤操作，测得计算ΔA测定=A测定管-A对照管=1.454-0.047=1.407，ΔA标准=A标准管-A空白管=0.292-0.047=0.245，根据样本质量计算酶活得：

C1（U/g 质量）=312.5×ΔA测定÷ΔA标准÷W×2（稀释倍数）=312.5×1.407÷0.245÷0.1×2=35893 U/g 质量。

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