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如何利用CRISPR改造植物基因組
閱讀：554 發(fā)布時間：2017-4-27如今，CRISPR技術已經(jīng)用于許多植物基因組的改造，包括的模式生物，如擬南芥和蒺藜苜蓿，以及重要的經(jīng)濟作物，如馬鈴薯、玉米、小麥、水稻和蘑菇等。盡管CRISPR系統(tǒng)在大多數(shù)物種中都通用，但涉及到植物細胞的編輯，還是不能一成不變。
Addgene的Joel McDade在此介紹了植物基因組的改造，突出了CRISPR系統(tǒng)針對植物的特定改變，并概括了科研人員的植物基因組編輯工具。
CRISPR的各個組分
總的來說，之前的實驗設計規(guī)則也適用于植物的基因編輯。不過，常用的CRISPR質(zhì)?？赡苄枰鲆恍└淖儯拍茉谥参锛毎衅鹱饔?。與其他模式系統(tǒng)一樣，Cas9或Cas9變異體和單鏈向導RNA（gRNA）的表達就足以修飾植物的基因組。
與其他生物一樣，gRNA也是由~20個核苷酸的靶向序列和~75個核苷酸的支架序列組成，不過驅動gRNA表達的啟動子則取決于所使用的細胞類型。在植物細胞中，gRNA的表達可通過植物特異的RNA pol III啟動子來驅動，如AtU6、TaU6、OsU6或OsU3。Addgene提供了30多種不含gRNA的骨架，方便你插入靶向序列，zui快構建好載體。
目前，研究人員已經(jīng)對一些Cas9變異體進行密碼子優(yōu)化，以加強在植物細胞中的翻譯。同時，他們也使用缺乏核酸酶活性的Cas9激活物（如dCas9-VP64）或阻遏物（dCas9-KRAB 或dCas9-SRDX）來激活或抑制植物細胞中的目標基因。
Cas9表達通常是由植物來源的RNA pol II啟動子驅動的。舉個例子，常用的RNA pol II啟動子包括花椰菜花葉病毒35S啟動子（CaMV 35S）或泛素啟動子。Addgene也提供了含有Cas9的質(zhì)粒，可用于目標基因的敲除、激活和抑制。之前提到的許多不含gRNA的骨架也包含Cas9，可同時表達Cas9和gRNA。
將這些組分導入植物細胞
一旦萬事俱備，下一步就是將CRISPR組分導入細胞了。記住，這些組分的導入對任何實驗而言都是至關重要的，若gRNA或Cas9表達失敗，結果肯定不樂觀。CRISPR組分可瞬時表達，也可穩(wěn)定表達，這取決于導入方法和細胞類型。
你可以選擇用PEG（聚乙二醇）來導入CRISPR組分并瞬時表達，但這種方法于原生質(zhì)體細胞，也就是細胞壁被去除的植物細胞。你也可以選擇農(nóng)桿菌介導的導入，它利用農(nóng)桿菌作為載體，將你感興趣的基因導入目的細胞。Johannes Stuttmann實驗室提供了pDGE Dicot Genome Editing Kit，包含了各種帶有Cas9且與農(nóng)桿菌兼容的載體。
對于植物的基因組改造，盡管許多細節(jié)不同，如啟動子、蛋白序列或轉染方法，但基本原理還是與其他系統(tǒng)無異。目前已經(jīng)有很多文獻發(fā)表，也有很多工具出現(xiàn)，因此你*不必擔心。大膽地去試試吧