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滾動式循環(huán)放大法IHC增敏方法

閱讀:734          發(fā)布時間:2010-7-9

滾動式循環(huán)放大(RCA)法是一種能夠在恒溫條件下,使標記有寡核苷酸探針(與組織細胞內的核苷酸無相關性)的抗體(特異性一抗或第二抗)與組織細胞內的抗原結合后,在DNA聚合酶的作用下,加入的寡核苷酸進行循環(huán)擴增,產(chǎn)生一條擴增的DNA序列拷貝產(chǎn)物,此時,標記在抗體上的寡核苷酸得到有效擴增(109倍),擴增后的產(chǎn)物與后續(xù)加入的標記有示蹤物的寡核苷酸進行互補雜交,在抗原—抗體周圍形成眾多帶有標記示蹤物的雜交體,zui后通過IHC方法再放大示蹤物。該方法具有很高的敏感性和特異性。首先要合成三條寡核苷酸探針(引物),然后將寡核苷酸與抗體結合,zui后進行RCA免疫組化染色。

RCA放大原理圖
左上為寡核苷酸標記的特異性抗體與組織細胞內的特異性抗原結合;右上為DNA聚合酶作用下與放大抗體分子上結合的核苷酸;左下為用標記示蹤劑的寡核苷酸進行互補雜交;右下為用IHC方法進一步放大檢測
(一)寡核苷酸的合成與抗體連接寡核苷酸
L標記抗體用寡核苷酸
5,—AAAAAAAAAAAAAAAAATGATCACAGCTGAGGATAGGACATGCGA—3,
2。循環(huán)放大寡核苷酸
5,—PCGCATGTCCTATCCTCAGCTGACAGAACTCACCTGTTAGACGCCACCAGCTCCAACTGTAAGATCGCTTAT—3,
3.帶有標記物的互補檢測用寡核甘酸
5,—XACTGTGAAGATCGCTTATX—3,(X=生物素),或用5,—FACTCTGAAGATCGCTTATF-3,(F=熒光素);或用5,—HRPACTGTGAAGATCGCTTAT HRP-3,(HRP=辣根過氧化物酶)。
(二)寡核苷酸與抗體的結合
連接用的抗體可以是特異性一抗,也可以是第二抗體或其他的連接二抗,如抗地高辛(Dig)、抗熒光素(FITC)或抗生物素(biotin)二抗。
1.抗體的脫鹽和活化
首先對抗體免疫球蛋白進行脫鹽,然后進行抗體活化。在41 nmol抗體分子中加入410mmol的GMBS[硫代—N—(4—馬來酰亞胺丁酰)硫代丁二酰亞胺,sulfo-N-(4—maleim—idobutyryloxy)sulfosuccinimide],暗處,37℃,在氮氣中30 rain,移人室溫中繼續(xù)反應30min,用PD-10色譜柱(用pH7.5 PBS平衡柱子)除去多余的磺化—GMBS,將活化抗體4℃濃縮。此時每一個抗體分子中含有多個馬來酰亞胺,可以用Ellman’s試劑滴定活化抗體的量,主要測定抗體分子上的巰基。抗體活化后與寡核苷酸連接。
2.活化抗體與寡核苷酸結合
將28.1nmol磺化GMBS活化抗體和142 nmol5硫醇寡核苷酸混合,總體積為825ul,室溫中反應2h,隨后移人4℃中反應過夜。
3.純化結合物
純化結合物一般先用陰離子交換色譜柱Q—sepharose(先用梯度鹽洗柱,然后加樣,洗脫,收集結合物),再用SephadexG-200色譜柱除去游離的寡核苷酸。純化后結合物中寡核苷酸和抗體之比為10:1,多數(shù)情況下,1個抗體分子可結合3~5個寡核苷酸。
(三)RCA免疫組化染色
(1)石蠟切片常規(guī)脫蠟至水,抗原修復后,PBS洗3×3min。
(2)滴加特異性一抗,37℃孵育1h,PBS洗3×3min。
(3)滴加適當稀釋的寡核苷酸標記二抗IgG 200nmol/L(用100mmol/L谷氨酸鉀—PBS稀釋),37℃孵育30min,PBS洗3×3cm,用100mmol/L谷氨酸鉀洗。
(4)循環(huán)寡核苷酸(170mmol/L),用φ29緩沖液稀釋[緩沖液內含250mmol/L(pH7.5)Tris—HCl,50mmol/L MgCl2,lmg/ml BSA,lmmol/L dATP,lmmol/L dCTP,lmmol/LdGTP,0.75 mmol/LdTTP,0.25mol/LFITC—12—dUTP],40ul/每片,37℃孵育30min,不洗,每張切片加入1ulφ29 DNA聚合酶(0.4U/ul),37℃繼續(xù)反應30min,PBS洗3×3mino.
(5)免抗FITC-AKP結合物1:1000稀釋,37℃30min;PBS洗3× 3min;0.02mol/LTris—HCl(pH9.0內含氯化鎂、左旋咪唑)洗20min。
(6)NBT/BCIP顯色30~240min,核固紅襯染。
(7)常規(guī)樹膠封片,結果觀察。

 

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