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公司動(dòng)態(tài)

DNA 的定?與接合反應(yīng)

閱讀:677          發(fā)布時(shí)間:2010-7-5

藥品試劑:
純化的gusA 片段及pQE31 BamHI/HindIII 片段
1% 6-well agarose gel
DNA 標(biāo)準(zhǔn)分子? (λMr, 0.5 μg/μL)

方法步驟:
1) 取4 支微?離心管,依下表加入DNA, TE-8.0 及追蹤染劑 (μL):

2) 短暫離心混合后,將各管樣品置65℃水浴5~10 min 后,移至冰浴?溫后進(jìn)?電泳分析。
3) 將膠體置于UV transilluminator 上觀(guān)察各色帶的??,與已知?的 λMr 比較,找出分別與#3, #4 ??相當(dāng)?shù)钠巍?br />4) 估計(jì) #3, #4 的DNA ?及計(jì)算每 μL 所含的莫耳數(shù)。

純化的gusA 片段與經(jīng)BamHI/HindIII 作用的pQE31 片段混合后,末端序?互補(bǔ)的部份會(huì)進(jìn)?黏合,但仍須藉由DNA ligase 催化phosphodiester bond 的形成,將缺口接合起?。

儀器用具:12℃恒溫槽

藥品試劑:
純化的gusA 片段及pQE31 BamHI/HindIII 片段
T4 DNA ligase (1 U/μL, Invitrogen)
5×T4 DNA ligase buffer (0.25 M Tris-HCl, pH 7.6; 50 mM MgCl2; 5 mM ATP; 5 mM DTT; 25% PEG-8000)

方法步驟:
1) 兩種DNA 片段于65℃水浴加熱10 min 后,置冰浴中。
2) 取5 支微?離心管置冰浴中,依下表所? (單位 μL) 依序加入各成份:

* Vector 與Insert 的比?為莫耳數(shù)比,DNA 總?為100 ng。
3) #1~#4 置于12℃反應(yīng)過(guò)夜,#5 則?加ligase,直接置于4℃冰箱。
4) #1~#4 反應(yīng)過(guò)夜后,以70℃加熱10 min,置冰浴中。

 

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