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果蠅類標(biāo)本發(fā)育晚期胚胎的制備
閱讀：616 發(fā)布時(shí)間：2011-3-24 1．所需溶液和特殊設(shè)備
漂白劑；庚烷；含3．7％甲醛的2mmol／L PIPES（pI-17．0）；甲醇；PBS。
解剖顯微鏡；探頭式超聲發(fā)生器。
2．操作步驟
EGTA，1mm01／L硫酸鎂，100 mmol／L （1）在盛有蘋果汁或葡萄汁的平皿內(nèi)采集胚胎，用水漂洗。
大多數(shù)果蠅專家習(xí)慣于在尼龍網(wǎng)濾器上漂洗胚胎標(biāo)本。
（2）將胚胎轉(zhuǎn)入50m1三角燒瓶或類似的玻璃容器中，以便搖動(dòng)時(shí)不會(huì)溢出。加25ml 50％漂白劑以去除絨毛膜。偶爾攪動(dòng)，3min后，用水洗數(shù)次，*洗凈。用解剖顯微鏡觀察胚胎。如果絨毛膜未*去除，重復(fù)漂白處理。
（3）通過吸出，盡可能去除大部分水。加10ml庚烷并攪動(dòng)兩次。然后加10ml含3．7％甲醛的2mmol／LEGTA、1mm01／L硫酸鎂、100mm01／LPIPES（pH7．0）。輕輕混合10～60min，使其混勻。庚烷將在卵黃膜上打一些小孔，以便甲醛透過并固定胚胎。將要孵出的胚胎已經(jīng)去除其卵黃膜，進(jìn)入水相的底部。而帶有卵黃膜的胚胎將仍處在庚烷／水相的界面。
串熔／固宋演作用時(shí)間的長短取決于所研究的特定抗原抗體復(fù)合物。去除胚胎的時(shí)間分別為5，10，20和40min，從中尋求一個(gè)*的時(shí)間。
（4）停止搖動(dòng)，使各液相分開。通過吸出，盡可能去除大部分水相（底部），不要碰到存在于甲醛和有機(jī)溶劑／水相界面的胚胎。
可將胚胎轉(zhuǎn)入塑料管中，在甲醇中—20C下可保存數(shù)年。
（5）加10ml甲醇。劇烈搖動(dòng)60s。仍貼在胚胎上的卵黃膜落入甲醇相（底部），將在其中膨脹。
（6）去除庚烷及盡可能大部分甲醇。用甲醇洗胚胎3次，每次5min以上，并搖動(dòng)，以去除殘余的庚烷。
（7）用PBS洗胚胎3次，每次5rain以上。
（8）將胚胎轉(zhuǎn)至小離心管中。去除PBS，并加入500t~lPBS，其中胚胎的體積僅占100ul。為了粉碎角質(zhì)膜，用探頭式超聲發(fā)生器處理2—3s，能量輸出設(shè)置zui低，觀察胚胎并掌握好超聲處理的時(shí)間，不應(yīng)該使過多的胚胎發(fā)生形態(tài)學(xué)損傷。超聲處理一個(gè)循環(huán)后大部分抗體便可溶出，但也可使用多輪循環(huán)，直至一些胚胎剛好出現(xiàn)損傷為止。多輪循環(huán)之間，將試管放在冰上，以使溫度降至zui低。
（9）用PBS洗胚胎3次，每次5min以上。
至此，已制備好的胚胎可加入一抗和用酶標(biāo)二級試劑進(jìn)行染色，或用熒光素標(biāo)記的二級試劑染色。