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phenol/chloroform 進(jìn)行DNA 萃取
閱讀：671 發(fā)布時(shí)間：2010-12-18儀器用具：微量離心機(jī)
藥品試劑：
Plasmid DNA 酵解產(chǎn)物： #1 （pBlueGus/HindIII）, #2 （pBlueGus/BamHI）；Phenol/chloroform/isoamyl alcohol （25:24:1） 以下簡(jiǎn)稱為PCI；Chloroform/isoamyl alcohol （24:1） 以下簡(jiǎn)稱為CI；3 M NaOAc （醋酸鈉pH 5.2）；純酒精及70%酒精
方法步驟：
◆ 注意！進(jìn)行這一部份實(shí)驗(yàn)的前，請(qǐng)先確定pBlueGus/HindIII 與pBlueGus/BamHI 兩者的酵解反應(yīng)都已經(jīng)*。
1） 于酵解反應(yīng) #1 與 #2 的微量離心管分別加入182 μL 去離子水。
2） 以200 μL PCI 萃取一次，亦即加入PCI 后，以Vortex 震蕩混合，并在室溫離心3 min。
3） 以微量移液器P200 將上層液移至新的微量離心管。
4） 加入等體積的CI，以Vortex 充分震蕩混合，并在室溫離心3 min。
5） 以微量移液器P200 將上層液移至新的微量離心管。
6） 加入0.1 倍體積的3 M NaOAc （pH 5.2） 及2.5 倍體積酒精。
7） 置于 -20℃過(guò)夜，或于 -80℃放置30 min，以便沉淀DNA。
隔天：
1） 自冷凍柜取出微量離心管，以14,000 rpm 離心10 min。
?? 注意： 請(qǐng)利用這一段時(shí)間參照『基本操作技術(shù)』所描述的步驟準(zhǔn)備一片1.2%洋菜膠體。 Ethidium bromide 是一種強(qiáng)力致癌物質(zhì)，嚴(yán)禁戴著手套到處亂摸！
2） 小心地倒出上清液。
3） 徐徐加入0.5 mL的70%酒精 （預(yù)先放在 -20℃預(yù)冷）。小心不要?jiǎng)拥紻NA沈淀。
4） 以14,000 rpm 低溫離心5 min 的后，倒去上清液，并將微量離心管倒置于一張干凈的衛(wèi)生紙上30 min，以便風(fēng)干DNA。也可以用SpeedVac 干燥DNA，但應(yīng)小心處理，以免DNA 沉淀不見(jiàn)了。
5） 以10 μL dH2O/DEPC溶解DNA。
6） 依照下表，自pBlueGus/BamHI 與pBlueGus/HindIII 各取1 μL DNA 以洋菜膠體電泳進(jìn)行分析，并估算其濃度。
?? DNA 濃度的估算請(qǐng)以 ??DNA/HindIII 量為參考值。
| 質(zhì)體DNA 酵解反應(yīng)與洋菜膠體電泳分析 | Southern 轉(zhuǎn)印分析 |
| 大腸桿菌抽取RNA | 重組質(zhì)體的限制酶分析 |
| Random priming | 胞外轉(zhuǎn)錄反應(yīng) （in vitro transcription） |
| 以DIG 標(biāo)定核酸探針 | 以phenol/chloroform 進(jìn)行DNA 萃取 |