化工儀器網(wǎng)
技術(shù)文章
以DIG 標定核酸
閱讀：422 發(fā)布時間：2010-12-18DNA探針一般可以用32P, 35S或非放射性物質(zhì)如biotin及digoxigenin （DIG） 加以標定；標定時利用DNA聚合酶的活性，在DNA聚合反應(yīng)中，另加入 [α-32P] dATP,[α-32P] dCTP或DIG-11-dUTP等標定物質(zhì)，所合成出來的即是被標定的核酸片段。目前常見的方法包括nick translation, random priming與polymerase chain reaction（PCR） 等。 若須對DNA進行end labeling時，可以進行kinase或filling-in reaction。
前者以 [γ-32P] ATP為phosphate donor，利用T4 polynucleotide kinase的活性對帶有5’-OH的DNA進行標定。人工合成的寡核苷酸 （oligonucleotides） 5’端為-OH group，可直接用于kinase reaction；一般DNA片段，若5’端帶有phosphate group，先經(jīng)phosphatase處理，再進行kinase reaction。 Filling-in reaction是將DNA以特定限制酶切開，露出recessed 3’ termini后，利用Klenow的活性把3’端補齊 （filling-in）；因此，只要加入適當?shù)?[α-32P] dNTP，即可在DNA的3’端進行標定。
此外，也可以應(yīng)用bacteriophage T4 DNA polymerase 的3’→5’ exonuclease 活性制造recessed 3’termini，再進行filling-in。 至于正意股或反意股RNA探針，則可以 [α-32P] UTP或DIG-11-UTP等為標定物質(zhì)，應(yīng)用胞外轉(zhuǎn)錄反應(yīng)加以標定。 下面要介紹的是目前zui常用的方法：random priming及PCR。