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[器材和試劑]

●  500ml無菌聚丙烯離心瓶

●  2L培養(yǎng)錐形瓶

●  RC5離心機(jī)和GS3轉(zhuǎn)頭（Sorvall）

●  2×TY/amp/glu培養(yǎng)基

●  TYE/amp/glu平板

●  含有25ug/ml卡那霉素和2％葡萄糖的TYE平板（TYE/kan/glu）

●  含100ug/ml氨芐青霉素和25ug/m1卡那霉素的2×TY培養(yǎng)基（2×TY/amp/kan）

●  輔助噬菌體（VCSMl3、R408或M13K  07  Stratagene、NEB或Amersham  Biosciences）

●  20％聚乙二醇（PEG）6000，2．5mol/L NaCl溶液

●  磷酸鹽緩沖液（PBS），pH 7．4

●  文庫甘油儲(chǔ)存料

 

[方法]

1．取適當(dāng)數(shù)量（參見上述討論）的甘油文庫儲(chǔ)存料接種到含有250m1 2×TY/amp/glu的  2L培養(yǎng)錐形瓶中。培養(yǎng)基的A₆₀₀值應(yīng)小于0．05。從每個(gè)培養(yǎng)瓶中取1ul鋪板確定起始接種物的細(xì)菌量。

2．在37℃下振蕩（300r/min）培養(yǎng)，直到As。。值為0．05（L 5～2．5h）

3．按照輔助噬菌體與細(xì)菌之比等于（10～20）：1的比例加入輔助噬菌體。孵育培養(yǎng)液，37℃30分鐘，需水浴中直立放置并不時(shí)攪拌；而后，37℃振蕩培養(yǎng)30分鐘。

4．從每瓶中取lul并用1ml 2×TY稀釋；取1ul及10ul分別在TYE/amp/glu和TYE/ kan/glu平板上鋪板，以確定輔助噬菌體感染有效性。每個(gè)平板上的克隆數(shù)應(yīng)當(dāng)大致相同，  同時(shí)卡那霉素抗性克隆數(shù)應(yīng)大于氨芐青霉素抗性克隆數(shù)的10％。

5．將500ml瓶裝入GS3轉(zhuǎn)頭，以3000r/min離心細(xì)菌培養(yǎng)液。棄去上清。

6．將細(xì)菌沉淀重懸于2×TY/amp/kan中，并分裝到2L錐形瓶中；其中的培養(yǎng)液不應(yīng)超過250ml。在25～30℃下振蕩（300r/min）培養(yǎng)過夜。

7．用GS3轉(zhuǎn)頭及500ml瓶以10000r/min 30分鐘離心菌液。將上清部分轉(zhuǎn)移至1個(gè)新的500ml瓶內(nèi)。

8．將l/10～1/5體積的PEG溶液加入到上清中，冰上放置1小時(shí)。這會(huì)使噬菌體沉淀，此時(shí)上清中會(huì)呈現(xiàn)云霧狀。

9．用GS3轉(zhuǎn)頭及500m1瓶以4000r/min，4℃15分鐘離心沉淀噬菌體。棄去上清。再離心“干”沉淀30秒，  以甩掉zui后幾滴上清。去除液體。用1/10體積的PBS重懸沉淀。

10．以10000r/minl5分鐘離心沉淀細(xì)菌碎片，并將上清轉(zhuǎn)移至1個(gè)新瓶中。

11．重復(fù)步驟7-9以進(jìn)一步純化噬菌體，但zui終重懸液的體積應(yīng)當(dāng)是起始培養(yǎng)液體積的1/50。這樣制備的噬菌體可以立即用于選擇，否則需按每份1013個(gè)噬菌體等量分裝，保存于-80℃。